這是一個關(guān)于質(zhì)粒dna的提取與酶切PPT，包括了實驗背景，質(zhì)粒類型，質(zhì)粒的應(yīng)用，質(zhì)粒特點，分離質(zhì)粒DNA方法，實驗?zāi)康�，實驗原理，實驗原理分析，試劑，實驗流程圖，實驗步驟，思考題，注意事項等內(nèi)容，實驗背景 質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。 大多數(shù)來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。 其復(fù)制和遺傳獨立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。質(zhì)粒類型 質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒 和 嚴(yán)緊型質(zhì)粒 松弛型質(zhì)粒：松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制需要一個質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過用氯霉素等蛋白合成抑制劑來增加。質(zhì)粒的應(yīng)用 大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。 質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值。 質(zhì)粒特點 質(zhì)粒能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞一些表型，是比病毒更簡單的原始生命，歡迎點擊下載質(zhì)粒dna的提取與酶切PPT。

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實驗背景 質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。 大多數(shù)來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。 其復(fù)制和遺傳獨立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。質(zhì)粒類型 質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒 和 嚴(yán)緊型質(zhì)粒 松弛型質(zhì)粒：松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制需要一個質(zhì)粒編碼的蛋白，質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過用氯霉素等蛋白合成抑制劑來增加。質(zhì)粒的應(yīng)用 大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。 質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值。 質(zhì)粒特點 質(zhì)粒能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞一些表型，是比病毒更簡單的原始生命。 質(zhì)粒通過細(xì)菌的結(jié)合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體， 是細(xì)菌有性繁殖的性因子. １９５２年由Lederburg正式命名為質(zhì)粒。 分離質(zhì)粒DNA方法 從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的 堿裂解法； 煮沸法； SDS法； 羥基磷灰石層析法等 各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收得率較高，提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切，連接與轉(zhuǎn)化。 實驗?zāi)康?掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理、步驟及各個主要試劑的作用。實驗原理質(zhì)粒是一種染色體外能夠穩(wěn)定遺傳的因子，具有雙鏈共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA分子。是染色體外小型（1-200kb）的共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。 實驗原理分析 試劑 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA 溶液Ⅱ：（新鮮配制） 0.2N NaOH 1% SDS 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 酚，氯仿，乙醇 RNase 瓊脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA 實驗步驟 1、將含有pQE30質(zhì)粒的大腸桿菌TG1 10μL接種到10ml含氨芐青霉素（100μg/ml）的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖過夜 2、取1.5ml菌液，轉(zhuǎn)入離心管中，10000r/min離心1min，吸凈上清液 3、將細(xì)菌沉淀重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ中，用渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀 實驗步驟 4、加200μl新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，輕緩顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物，禁止劇烈震蕩，冰浴2min 5、加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液Ⅲ在黏稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，隨后冰浴5min 6、用微量臺式高速離心機12000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中 實驗步驟 7、加等體積酚—氯仿，劇烈震蕩1min后，12000r/min離心5min，將上層液轉(zhuǎn)入另一離心管中 8、加等體積氯仿—異戊醇，劇烈震蕩10s后，12000r/min離心1min，將上層液轉(zhuǎn)入另一離心管中 9、室溫下加入兩倍體積的無水乙醇，振蕩混合，室溫下靜置5min 實驗步驟 10、12000r/min離心10min，去上清液，加1ml70%乙醇，短暫振搖，然后再12000r/min離心5min 11、除去所有上清液，待殘余乙醇揮發(fā)干凈后，加30μLTE緩沖液（PH=8.0）溶解沉淀，再加1μlRNaseA（1mg/ml），37℃保溫15min，取出后即可用酶切分析或置于-20℃保存?zhèn)溆?。思考題１．簡要敘述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用分別是什么？加入上述溶液時要注意哪些問題？２．實驗中加入酚、無水乙醇和RNaseA的作用分別是什么？ 注意事項溶液1的作用：分散細(xì)胞，蟄合金屬離子使金屬酶失活。注意：加入溶液1后，一定要徹底懸浮細(xì)菌沉淀，否則所提質(zhì)粒DNA的純度及得率會大大降低。注意事項溶液2的作用：使細(xì)胞壁在堿性條件下破裂，核酸和蛋白質(zhì)變性。注意：此步需輕柔混合，不要劇烈震蕩，以免打亂基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組片段。此時菌液應(yīng)變得清涼粘稠，所用時間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。注意事項溶液3的作用：使PH值恢復(fù)至中性，質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體DNA與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物沉淀。注意：溶液3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。dkm紅軟基地

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