這是質粒dna的提取ppt，包括了基本原理，操作步驟，注意事項，實驗室安全，細菌質粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等，操作步驟及注意事項，其它注意事項，PCR技術，基本原理，反應動力學，使用步驟及注意事項，反應參數要素，PCR優(yōu)化等內容，歡迎點擊下載。

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質粒DNA的提取和PCR技術 質粒提取 基本原理 操作步驟 注意事項 實驗室安全 基本原理 細菌質粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質粒都是存在于細胞質中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份.質粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，堿裂解法是最常用的方法。 基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與線性DNA發(fā)生變性，質粒釋放到上清中。當加入中和液后，因為閉環(huán)的質粒DNA分子雖然氫鍵破壞但雙鏈并不分離。能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA變性相互纏繞成大分子復合物而呈絮狀被SDS覆蓋，當加入溶液三后形成PDS被離心時可沉淀下來。 試劑準備 ： 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡滲透壓，調節(jié)PH值，有利懸浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 調節(jié)PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和離子 抑制DNase活性 高壓滅菌15min ，貯存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解細菌，變性線性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并與SDS作用沉淀 4.苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）苯酚變性抽提蛋白，為tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚與水互溶。異戊醇的作用是降低表面張力，可以減少泡沫 5.異丙醇，乙醇（無水乙醇、70%乙醇）沉淀質粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 RNase A：10mg/ml 操作步驟及注意事項 1挑取單菌落，接種于含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)14～18 h。-培養(yǎng)時間不能太長，否則細菌老化，代謝產物太多。影響質粒質量。 2取1.5ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心12000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。3.將細菌沉淀重懸于100μl預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。4.加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細胞膜裂解，DNA變性。-放置時間不能太長。因為在堿性條件下基因組DNA會慢慢斷裂 �；靹騽幼饕�輕柔，既保證細菌沉淀在試劑中充分擴散又要避免機械剪切已變性的質粒DNA和染色體基因組DNA 。 5.加入150μl預冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數次混勻，見白色絮狀沉淀，冰上放置3-5min。-中和溶液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀。6.12000g離心10min取上清，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心12000g10min。-抽提掉剩余蛋白。7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入0.5~0.7倍體積的異丙醇，混勻，4℃離心12000g，10min。-可以用兩倍體積的無水乙醇，室溫放置2-5min 離心。不要沉淀太久8.1ml 75%乙醇洗滌沉淀1次，4℃離心，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。-不要太干，否則不易溶解。9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存?zhèn)溆谩?10.瓊脂糖電泳檢測。檢測，定量。 其它注意事項： 1。質粒質量： 首先實驗菌種生長的好壞直接影響質粒DNA的提取，因此對存放時間較長的菌種需要事先加以活化。其次操作過程注意：避免基因組斷裂，除凈蛋白，鹽離子清洗干凈。 質粒數量：同量搖菌量中質粒量取決于質�？截悢�。低拷貝數質�？梢酝ㄟ^添加氯霉素來增大拷貝數。 2。陽性菌破壁裂解比較困難，可以先用溶菌酶處理。 溶液二中NaOH不要暴露在空氣中太久。可能會與空氣中的CO2 與NaOH作用，減弱了其堿性。 3。瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時 如果能看到三條帶，這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起），注意堿法抽提得到質粒樣品中應不含線性DNA ，另外如果發(fā)現運動得較慢的帶，可能是由于操作不慎污染的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 實驗室安全： 1。培養(yǎng)細菌的容器用過后都要及時進行滅菌，細菌培養(yǎng)基上清不要隨便丟棄，應存放在一起進行滅菌處理，以免污染環(huán)境。 2。吸取苯酚時應注意安全。苯酚腐蝕性很強。吸取氯仿 異戊醇時要在通風櫥中進行，氯仿 可引起神經系統(tǒng)功能紊亂要引起肝臟損害 。異戊醇其蒸氣或霧對眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用 3。電泳時注意避免EB污染。 PCR技術 基本原理 反應動力學 使用步驟及注意事項 反應參數要素 PCR優(yōu)化 PCR技術 聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ，PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。 它具有特異、敏感、產率高、 快速、 簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷 。-可以用于基因克隆，目的基因檢測等。 發(fā)展：Taq DNA聚合酶：分離于溫泉菌中，耐高溫。 PCR和TaqDNA聚合酶被美國《科學》雜志1989年的“年度分子”，并被列為80年代10項重大科學發(fā)明之首 基本原理： 類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 PCR的反應動力學 ： PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。 反應曲線：反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA 片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期， 即出現“停滯效應” ，這種效應稱平臺期數（原因：PCR 擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素）。 操作步驟注意事項： 1。配置反應體系。 標準的PCR反應體系： 　　　10×擴增緩沖液 　 1ul　　　4種dNTP混合物 　 200umol/L　　　引物 　　　　 　 各1～10pmol　　　　模板DNA 　　　 　10～200ng　　 　　Taq DNA聚合酶 　 0.25u　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　加雙或三蒸水至 　10ul 2。 在加熱至90℃以上的PCR儀中預變性94℃ 2分鐘， 然后循環(huán): 94℃ 1分鐘， 50℃ 1分鐘， 72℃ 1.5分鐘，共30輪循環(huán)。 3. 循環(huán)結束后， 72℃ 10分鐘，4℃保存。 4. 電泳結束，觀察 注意問題： 1。防止核酸污染：PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。 吸樣槍:吸樣槍污染值得注意.由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸 入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源。吸頭、小離心管應一次性使用 。 開關蓋時注意不要接觸到內壁，并且不要開蓋時間太長，以免污染。 2。預混和分裝PCR試劑:PCR反應液應預先 配制好，然后小量分裝。節(jié)省時間并保證各管成分平行 。最好在加樣時都在冰上低溫進行，以防止加入酶后反應立即開始。 3。陽性對照與陰性對照的設立。-重要！ 有利于問題的解決，對于優(yōu)化條件以及排除污染可能性都很有用！ 反應參數要素： 1。PCR反應五要素 （1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。保真性：rTaq-1~2kbp，LaTaq-~20kbp，Pfu（Pyrobest）-. 吸取時注意，保存在甘油中故比較粘稠。 （2）dNTP的質量與濃度 ：在PCR反應中，一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L 。4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。 （3）模板；模板可以是DNA片斷，基因組，質粒，噬菌體，菌液等任何含DNA生物樣品�？梢允菃捂湻肿樱�也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子 一般反應中的模板數量為102 -105 拷貝。模板純化程度影響擴增效率。 4）Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。 （5）引物：PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。 引物設計的好壞是決定PCR成功與否最重要的因素。 引物設計原則： 1)引物長度約為18-30bp。 2)引物中G+C含量通常為40%-60%， G+C太少擴增效果不好，G+C過多易出現非特異條帶。GC含量決定引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T). 3)四種堿基應隨機分布，在3‘端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣易導致錯配。 4）引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應， 以減少由于密碼子擺動產生的不配對。 5)在引物內， 尤其在3'端應不存在二級結構。 6)兩引物之間尤其在3‘端不能互補， 以防出現引物二聚體， 減少產量。 7)引物5‘端對擴增特異性影響不大， 可在引物設計時加上限制酶位點，通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。 8)引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩(wěn)定的二級結構， 以免產生非特異性擴增，影響產量。 引物設計軟件： Primer5.0， 6.0 2。PCR反應條件的選擇：溫度、時間和循環(huán)次數 溫度與時間： 變性溫度：一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性 。太低解鏈不完全，太高影響酶活。 退火(復性)溫度與時間 ：退火溫度影響PCR特異性的。太高不能很好復性，太低會有非特異結合。提高退火溫度可以提高特異性。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。選擇合適的溫度 ：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 復性溫度=Tm值-(5～10℃)在此范圍內進行優(yōu)化。提高退火溫度可以提高特異性。 復性時間一般為30～60sec 延伸溫度與時間 ：一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃。延伸速度一般1kb/min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，時間要稍長些。 循環(huán)次數：循環(huán)次數決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數選在30～40次之間，循環(huán)次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多 PCR優(yōu)化及特異性問題 1。沒有擴增出目的條帶： （1）引物設計合成有無問題。（2）模板:模板中含有雜蛋白質，含有Taq酶抑制劑。擴增的模板中GC含量高時或者含有重復序列時，使用GC Buffer。 （3）酶失活（4）退火溫度太高 2。有目的條帶，但是很弱 ： （1）調整Mg++濃度（2）降低退火溫度---（可以考慮增加摸板量；.增加延伸時間；用產物做二次pcr 3.出現非特異性擴增(假陽性)原因： （1）引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。（2）Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數過多。 4。帶擴增目的條帶都帶形模糊或者呈成片條帶。 （1）引物濃度不適合或者退火溫度不合適，可以改變濃度或者用梯度PCR，降落pcr摸索最佳條件。 （2）模板純度不夠，需重新純化。 （3）酶量過多 5。陰性對照管中擴增出目的條帶： 原因：器具如管子，槍頭等有污染，或者與其他實驗管交互污染。 幾種PCR: 1.降落PCR:--特異性 通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴謹的退火條件提高特異性。循環(huán)設在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。這樣，特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴增，并在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴增占據優(yōu)勢。 2.巢式PCR:---特異性 nPCR首先用一對外引物進行第一輪PCR，然后再使用第一對引物擴增的DNA序列內部的一對引物再次擴散，所以稱為巢式PCR。由于使用了兩對引物并且進行了兩輪擴增反應，因此試驗的敏感性和特異性均增強。在一定情況下，這種方法對減少后擴增產物的污染問題極為有用.可以增加有限量靶序列的靈敏度，并且提高了困難PCR的特異性.可以用于如稀有mRNA，5‘ RACE等. 3.反向P CR可用于擴增已知在核心區(qū)旁邊的未知序列。 易錯PCR;在PCR時引入錯配，一般用于定向進化等。 重疊延伸PCR技術(gene splicing by overlap extension PCR，簡稱SOE PCR)由于采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來.用于基因重組等。sEK紅軟基地

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