這是質(zhì)粒dna的提取ppt，包括了基本原理，操作步驟，注意事項(xiàng)，實(shí)驗(yàn)室安全，細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等，操作步驟及注意事項(xiàng)，其它注意事項(xiàng)，PCR技術(shù)，基本原理，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，使用步驟及注意事項(xiàng)，反應(yīng)參數(shù)要素，PCR優(yōu)化等內(nèi)容，歡迎點(diǎn)擊下載。

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質(zhì)粒DNA的提取和PCR技術(shù) 質(zhì)粒提取 基本原理 操作步驟 注意事項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)室安全 基本原理 細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份.質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，堿裂解法是最常用的方法。 基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與線性DNA發(fā)生變性，質(zhì)粒釋放到上清中。當(dāng)加入中和液后，因?yàn)殚]環(huán)的質(zhì)粒DNA分子雖然氫鍵破壞但雙鏈并不分離。能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA變性相互纏繞成大分子復(fù)合物而呈絮狀被SDS覆蓋，當(dāng)加入溶液三后形成PDS被離心時(shí)可沉淀下來(lái)。 試劑準(zhǔn)備 ： 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡滲透壓，調(diào)節(jié)PH值，有利懸浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 調(diào)節(jié)PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和離子 抑制DNase活性 高壓滅菌15min ，貯存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解細(xì)菌，變性線性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并與SDS作用沉淀 4.苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）苯酚變性抽提蛋白，為tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚與水互溶。異戊醇的作用是降低表面張力，可以減少泡沫 5.異丙醇，乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇）沉淀質(zhì)粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 RNase A：10mg/ml 操作步驟及注意事項(xiàng) 1挑取單菌落，接種于含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)14～18 h。-培養(yǎng)時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則細(xì)菌老化，代謝產(chǎn)物太多。影響質(zhì)粒質(zhì)量。 2取1.5ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心12000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。3.將細(xì)菌沉淀重懸于100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。4.加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數(shù)次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲�，并將離心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解，DNA變性。-放置時(shí)間不能太長(zhǎng)。因?yàn)樵趬A性條件下基因組DNA會(huì)慢慢斷裂 �；靹騽�(dòng)作要輕柔，既保證細(xì)菌沉淀在試劑中充分?jǐn)U散又要避免機(jī)械剪切已變性的質(zhì)粒DNA和染色體基因組DNA 。 5.加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見(jiàn)白色絮狀沉淀，冰上放置3-5min。-中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。6.12000g離心10min取上清，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心12000g10min。-抽提掉剩余蛋白。7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入0.5~0.7倍體積的異丙醇，混勻，4℃離心12000g，10min。-可以用兩倍體積的無(wú)水乙醇，室溫放置2-5min 離心。不要沉淀太久8.1ml 75%乙醇洗滌沉淀1次，4℃離心，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。-不要太干，否則不易溶解。9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存?zhèn)溆谩?10.瓊脂糖電泳檢測(cè)。檢測(cè)，定量。 其它注意事項(xiàng)： 1。質(zhì)粒質(zhì)量： 首先實(shí)驗(yàn)菌種生長(zhǎng)的好壞直接影響質(zhì)粒DNA的提取，因此對(duì)存放時(shí)間較長(zhǎng)的菌種需要事先加以活化。其次操作過(guò)程注意：避免基因組斷裂，除凈蛋白，鹽離子清洗干凈。 質(zhì)粒數(shù)量：同量搖菌量中質(zhì)粒量取決于質(zhì)�？截悢�(shù)。低拷貝數(shù)質(zhì)�？梢酝ㄟ^(guò)添加氯霉素來(lái)增大拷貝數(shù)。 2。陽(yáng)性菌破壁裂解比較困難，可以先用溶菌酶處理。 溶液二中NaOH不要暴露在空氣中太久。可能會(huì)與空氣中的CO2 與NaOH作用，減弱了其堿性。 3。瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí) 如果能看到三條帶，這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起），注意堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中應(yīng)不含線性DNA ，另外如果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)得較慢的帶，可能是由于操作不慎污染的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 實(shí)驗(yàn)室安全： 1。培養(yǎng)細(xì)菌的容器用過(guò)后都要及時(shí)進(jìn)行滅菌，細(xì)菌培養(yǎng)基上清不要隨便丟棄，應(yīng)存放在一起進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。 2。吸取苯酚時(shí)應(yīng)注意安全。苯酚腐蝕性很強(qiáng)。吸取氯仿 異戊醇時(shí)要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，氯仿 可引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂要引起肝臟損害 。異戊醇其蒸氣或霧對(duì)眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用 3。電泳時(shí)注意避免EB污染。 PCR技術(shù) 基本原理 反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 使用步驟及注意事項(xiàng) 反應(yīng)參數(shù)要素 PCR優(yōu)化 PCR技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ，PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，使肉眼能直接觀察和判斷 。-可以用于基因克隆，目的基因檢測(cè)等。 發(fā)展：Taq DNA聚合酶：分離于溫泉菌中，耐高溫。 PCR和TaqDNA聚合酶被美國(guó)《科學(xué)》雜志1989年的“年度分子”，并被列為80年代10項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首 基本原理： 類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) ： PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。 反應(yīng)曲線：反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期， 即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” ，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)（原因：PCR 擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩兀��? 操作步驟注意事項(xiàng)： 1。配置反應(yīng)體系。 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 　　　10×擴(kuò)增緩沖液 　 1ul　　　4種dNTP混合物 　 200umol/L　　　引物 　　　　 　 各1～10pmol　　　　模板DNA 　　　 　10～200ng　　 　　Taq DNA聚合酶 　 0.25u　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　加雙或三蒸水至 　10ul 2。 在加熱至90℃以上的PCR儀中預(yù)變性94℃ 2分鐘， 然后循環(huán): 94℃ 1分鐘， 50℃ 1分鐘， 72℃ 1.5分鐘，共30輪循環(huán)。 3. 循環(huán)結(jié)束后， 72℃ 10分鐘，4℃保存。 4. 電泳結(jié)束，觀察 注意問(wèn)題： 1。防止核酸污染：PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問(wèn)題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。 吸樣槍:吸樣槍污染值得注意.由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸 入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源。吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用 。 開(kāi)關(guān)蓋時(shí)注意不要接觸到內(nèi)壁，并且不要開(kāi)蓋時(shí)間太長(zhǎng)，以免污染。 2。預(yù)混和分裝PCR試劑:PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先 配制好，然后小量分裝。節(jié)省時(shí)間并保證各管成分平行 。最好在加樣時(shí)都在冰上低溫進(jìn)行，以防止加入酶后反應(yīng)立即開(kāi)始。 3。陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的設(shè)立。-重要！ 有利于問(wèn)題的解決，對(duì)于優(yōu)化條件以及排除污染可能性都很有用！ 反應(yīng)參數(shù)要素： 1。PCR反應(yīng)五要素 （1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。保真性：rTaq-1~2kbp，LaTaq-~20kbp，Pfu（Pyrobest）-. 吸取時(shí)注意，保存在甘油中故比較粘稠。 （2）dNTP的質(zhì)量與濃度 ：在PCR反應(yīng)中，一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L 。4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。 （3）模板；模板可以是DNA片斷，基因組，質(zhì)粒，噬菌體，菌液等任何含DNA生物樣品。可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子 一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 拷貝。模板純化程度影響擴(kuò)增效率。 4）Mg2+濃度：Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 （5）引物：PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 引物設(shè)計(jì)的好壞是決定PCR成功與否最重要的因素。 引物設(shè)計(jì)原則： 1)引物長(zhǎng)度約為18-30bp。 2)引物中G+C含量通常為40%-60%， G+C太少擴(kuò)增效果不好，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。GC含量決定引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T). 3)四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3‘端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)配。 4）引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)， 以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)。 5)在引物內(nèi)， 尤其在3'端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。 6)兩引物之間尤其在3‘端不能互補(bǔ)， 以防出現(xiàn)引物二聚體， 減少產(chǎn)量。 7)引物5‘端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大， 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)，通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個(gè)保護(hù)堿基。 8)引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無(wú)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響產(chǎn)量。 引物設(shè)計(jì)軟件： Primer5.0， 6.0 2。PCR反應(yīng)條件的選擇：溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù) 溫度與時(shí)間： 變性溫度：一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性 。太低解鏈不完全，太高影響酶活。 退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間 ：退火溫度影響PCR特異性的。太高不能很好復(fù)性，太低會(huì)有非特異結(jié)合。提高退火溫度可以提高特異性。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。選擇合適的溫度 ：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)在此范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化。提高退火溫度可以提高特異性。 復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec 延伸溫度與時(shí)間 ：一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃。延伸速度一般1kb/min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，時(shí)間要稍長(zhǎng)些。 循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多 PCR優(yōu)化及特異性問(wèn)題 1。沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶： （1）引物設(shè)計(jì)合成有無(wú)問(wèn)題。（2）模板:模板中含有雜蛋白質(zhì)，含有Taq酶抑制劑。擴(kuò)增的模板中GC含量高時(shí)或者含有重復(fù)序列時(shí)，使用GC Buffer。 （3）酶失活（4）退火溫度太高 2。有目的條帶，但是很弱 ： （1）調(diào)整Mg++濃度（2）降低退火溫度---（可以考慮增加摸板量；.增加延伸時(shí)間；用產(chǎn)物做二次pcr 3.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增(假陽(yáng)性)原因： （1）引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。（2）Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多。 4。帶擴(kuò)增目的條帶都帶形模糊或者呈成片條帶。 （1）引物濃度不適合或者退火溫度不合適，可以改變濃度或者用梯度PCR，降落pcr摸索最佳條件。 （2）模板純度不夠，需重新純化。 （3）酶量過(guò)多 5。陰性對(duì)照管中擴(kuò)增出目的條帶： 原因：器具如管子，槍頭等有污染，或者與其他實(shí)驗(yàn)管交互污染。 幾種PCR: 1.降落PCR:--特異性 通過(guò)在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開(kāi)始，然后每個(gè)循環(huán)降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。這樣，特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，并在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。 2.巢式PCR:---特異性 nPCR首先用一對(duì)外引物進(jìn)行第一輪PCR，然后再使用第一對(duì)引物擴(kuò)增的DNA序列內(nèi)部的一對(duì)引物再次擴(kuò)散，所以稱為巢式PCR。由于使用了兩對(duì)引物并且進(jìn)行了兩輪擴(kuò)增反應(yīng)，因此試驗(yàn)的敏感性和特異性均增強(qiáng)。在一定情況下，這種方法對(duì)減少后擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問(wèn)題極為有用.可以增加有限量靶序列的靈敏度，并且提高了困難PCR的特異性.可以用于如稀有mRNA，5‘ RACE等. 3.反向P CR可用于擴(kuò)增已知在核心區(qū)旁邊的未知序列。 易錯(cuò)PCR;在PCR時(shí)引入錯(cuò)配，一般用于定向進(jìn)化等。 重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR，簡(jiǎn)稱SOE PCR)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái).用于基因重組等。sEK紅軟基地

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