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熒光原位雜交 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization， FISH) 熒光原位雜交是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)，以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導(dǎo)分子(reporter molecule)結(jié)合，雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料. 熒光原位雜交 FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。 目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。。 原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗(yàn)均 需重新標(biāo)記探針，已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較和時(shí)間的曝光時(shí)間和對(duì)環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時(shí)，需要較多的分裂進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計(jì)數(shù)上的誤 差等。 與之比FISH的優(yōu)點(diǎn) ①操作操作簡(jiǎn)便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可使用二年 ②方法敏感，能迅速得到結(jié)果 ③在同一標(biāo)本上，可同時(shí)檢測(cè)幾種不同探針. ④不僅可用于分裂期細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于間期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究. 缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。 FISH技術(shù)包括下列幾個(gè)步驟： 1）探針的制備和標(biāo)記 2）探針及標(biāo)本變性 3）雜交 4）洗脫 5）雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針） 6）封片 7）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果 探針的制備和標(biāo)記 探針是一段帶有熒光色素或（半）抗原的核苷酸序列。其長(zhǎng)度介于15至數(shù)千個(gè)核苷酸之間，但以250~650個(gè)核苷酸雜交效果最好 探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。 間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大，從而可以檢測(cè)500bp的片段。 直接標(biāo)記是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡(jiǎn)單，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。 （1）種類：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）應(yīng)用 （a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗(yàn)證； （b）確定染色體微小缺失與重復(fù)； （c）染色體斷裂點(diǎn)分析。 （d）間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷。 單拷貝探針 單拷貝探針 簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針(simple repetitive probes)——異染色質(zhì)著絲粒探針(heterochromatic centromer probes) 其靶序列為α衛(wèi)星DNA或衛(wèi)星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色體的著絲粒和異染色質(zhì)區(qū)域，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次。特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)應(yīng)用：(a)標(biāo)記染色體識(shí)別 (b)染色體數(shù)目異常檢測(cè) (c)間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究和臨床診斷 簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針 簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針 間期細(xì)胞遺傳學(xué)的意義：細(xì)胞分裂期僅占整個(gè)細(xì)胞周期的幾分之一至幾十分之一，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和相應(yīng)處理才能獲得染色體。人體的大部分細(xì)胞并不進(jìn)行分裂，很難通過培養(yǎng)獲得中期染色體分裂相，間期FISH為這一時(shí)期遺期傳物質(zhì)的研究提供了可能，而且快速。 染色體涂染探針(chromosome painting probes) 整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針探針來源：（1）含有人單條染色體的人-嚙齒類(human-rodent)體細(xì)胞雜種組織融合的產(chǎn)物；（2）熒光激活的流式細(xì)胞儀(fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS)分離整條染色體DNA，并以載體克隆/PCR擴(kuò)增；（3）顯微切割得到染色體或染色體片段，PCR擴(kuò)增； 應(yīng)用　（1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析； 　（2）不同物種間的同源性比較； �。�3）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。 染色體涂染探針人類染色體結(jié)構(gòu)分析 染色體涂染探針：染色體結(jié)構(gòu)異常分析 多色FISH（muti-color FISH) 多色復(fù)合染色體FISH探針(multiplex FISH， M-FISH probes) 兩種以上不同的非同位素標(biāo)記，不同的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，通過不同的濾光片組合或極少數(shù)幾種非同位素標(biāo)記探針后，按照不同的比例混合，可以顯示多種顏色。 多色復(fù)合染色體FISH探針 探針及標(biāo)本的變性 1）探針變性 將探針在75oC恒溫水浴中溫育5min，立即置0oC，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。 2）標(biāo)本變性 ①將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50oC培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。 ②取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75oC的體積分?jǐn)?shù)70％甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。 ③立即按順序?qū)��?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70％、體積分?jǐn)?shù)90％和體積分?jǐn)?shù)100％冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。 雜交 將已變性或預(yù)退火的DNA探針10μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37oC雜交過夜（約15～17h）。 由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長(zhǎng)，因此為了保持標(biāo)本的濕潤(rùn)狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。 （1） 在玻片的雜交部位加150μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37oC溫育20min。 （2） 去掉保鮮膜，再加150μL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋， 37oC繼續(xù)溫育40min。 （3） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50oC的洗脫液中洗滌3次，每次5min。 （4） 在玻片標(biāo)本的雜交部位加150μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37oC溫育20min。 （5） 去掉保鮮膜，加150μL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37oC溫育40min。 （6） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50oC的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。 （7） 重復(fù)步驟(1)、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。 （8） 取出玻片，自然干燥。 （9） 取200μL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。 可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70oC的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。 先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源。 FITC的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色， 經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)�在的位置發(fā)出綠色熒光。 所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)及濾光鏡選擇 FISH技術(shù)的應(yīng)用1）基因（或DNA片段）的染色體定位；2）染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)；3）間期細(xì)胞遺傳學(xué)（絨毛/羊水/精子/卵裂球/其它間期細(xì)胞研究與　　診斷）；4）腫瘤遺傳學(xué)研究 FISH的展望 FISH的展望 FISH技術(shù)和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）結(jié)合，可以更精確地描述原必于染色體長(zhǎng)短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體梳型或復(fù)制片段的性質(zhì)。 Thank you!ljW紅軟基地

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