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第十一章   多肽藥物分析L8T紅軟基地
一、前言L8T紅軟基地
二、合成多肽藥物藥學研究的基本考慮L8T紅軟基地
三、合成多肽藥物藥學研究的主要內(nèi)容L8T紅軟基地
（一）制備工藝研究L8T紅軟基地
（二）結(jié)構(gòu)確證研究L8T紅軟基地
（三）制劑處方工藝研究L8T紅軟基地
（四）質(zhì)量研究與質(zhì)量標準L8T紅軟基地
（五）穩(wěn)定性研究L8T紅軟基地
一、前言L8T紅軟基地
1.1多肽類藥物產(chǎn)生的背景:L8T紅軟基地
          20世紀70年代生物技術在生命科學領域的應用，使多肽等生物技術藥物的研究進展迅速；L8T紅軟基地
多肽固相合成技術L8T紅軟基地
高效液相色譜（HPLC）純化L8T紅軟基地
分析技術的發(fā)展L8T紅軟基地
1.2合成多肽藥物概念:L8T紅軟基地
          指采用化學合成方法制備的多肽類藥物。包括采用液相或固相合成方法制備的多肽藥物。L8T紅軟基地
1.3化學合成在多肽分類:L8T紅軟基地
純天然多肽：L8T紅軟基地
經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的天然多肽:L8T紅軟基地
   增加多肽與受體的親和力、選擇性;L8T紅軟基地
   對酶降解的抵抗力、改善藥代動力學特性;L8T紅軟基地
   甚至由受體的激動劑變?yōu)檗卓箘?L8T紅軟基地
人工設計出的多肽:L8T紅軟基地
   多肽固相合成和組合化學產(chǎn)生了肽庫，短時間內(nèi)獲得大量的多肽化合物L8T紅軟基地
   藥物篩選的效率不斷提高L8T紅軟基地
   獲得多肽類藥物的可能性提高L8T紅軟基地
二、合成多肽藥物藥學研究的基本考慮L8T紅軟基地
1、關于多肽（原料藥）合成工藝選擇的考慮L8T紅軟基地
      目前主要有液相合成和固相合成兩種方法。L8T紅軟基地
液相合成:逐步合成或片段縮合方法。L8T紅軟基地
逐步合成法:L8T紅軟基地
片段縮合:L8T紅軟基地
液相合成的優(yōu)點:L8T紅軟基地
       中間產(chǎn)物純化、中間產(chǎn)物的理化常數(shù)、可以隨意進行非氨基酸修飾、可以避免氨基酸缺失L8T紅軟基地
缺點是較為費時、費力等。L8T紅軟基地
固相合成:L8T紅軟基地
 優(yōu)點L8T紅軟基地
          簡化了每步反應的后處理操作，避免因手工操作和物料轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失，產(chǎn)率較高且能夠?qū)崿F(xiàn)自動化等L8T紅軟基地
缺點L8T紅軟基地
          每步中間產(chǎn)物不可以純化，必須采用較大的氨基酸過量投料，粗品純度不如液相合成物，必需通過可靠的分離手段進行純化等。L8T紅軟基地
液相合成法較適于合成短肽；L8T紅軟基地
固相合成法更適于合成中、長肽。L8T紅軟基地
2、關于多肽結(jié)構(gòu)確證研究的考慮L8T紅軟基地
          氨基酸組成分析、質(zhì)譜、氨基酸序列測定等對其結(jié)構(gòu)確證有重要意義。L8T紅軟基地
          對于具有一定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮其活性的多肽，應進行必要的立體化學研究。L8T紅軟基地
3、關于多肽制劑處方工藝研究的考慮L8T紅軟基地
          合成多肽藥物制劑研究的總體目標和要求與其它類型化學藥物制劑是一致的，即通過一系列研究工作，保證制劑劑型選擇依據(jù)充分、處方合理、工藝穩(wěn)定、生產(chǎn)過程得到有效控制，并能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。L8T紅軟基地
但是，由于多肽藥物的生物活性可能和其空間結(jié)構(gòu)相關，多肽分子中存在大量的酰胺鍵，另外還可能有羧基、羥基、氨基、巰基等較為活潑的基團，較易水解或降解，因此了解合成多肽藥物的物理化學穩(wěn)定性和生物學穩(wěn)定性對選擇適宜的劑型和合理的處方、制備工藝有重要作用。L8T紅軟基地
4、關于多肽藥物質(zhì)量研究的考慮L8T紅軟基地
多肽藥物質(zhì)量研究與其它類型化學藥物基本一致。L8T紅軟基地
不同之處在于:L8T紅軟基地
   氨基酸組成分析；中、長肽要做效價、免疫原性和抗原活性等研究。L8T紅軟基地
注意工藝雜質(zhì):L8T紅軟基地
缺失(不完全)肽、斷裂肽、去酰胺多肽、氨基酸側(cè)鏈的不完全脫保護所形成的副產(chǎn)物、氧化肽、二硫鍵交換的產(chǎn)物、非對映異構(gòu)的多肽、低聚物和/或聚合物L8T紅軟基地
毒性試劑和溶劑L8T紅軟基地
5、關于多肽藥物穩(wěn)定性研究的考慮L8T紅軟基地
多肽藥物不穩(wěn)定的原因:L8T紅軟基地
水解、氧化、外消旋化、二硫鍵的斷裂及重排、β消除、凝聚、沉淀、吸附等。L8T紅軟基地
穩(wěn)定性研究應根據(jù)多肽藥物穩(wěn)定性的特點合理選擇試驗條件、考察項目。L8T紅軟基地
三、合成多肽藥物藥學研究的主要內(nèi)容L8T紅軟基地
原料藥的制備工藝研究L8T紅軟基地
結(jié)構(gòu)確證研究L8T紅軟基地
制劑的處方工藝研究L8T紅軟基地
質(zhì)量研究和質(zhì)量標準的制訂L8T紅軟基地
穩(wěn)定性研究L8T紅軟基地
（一）原料藥制備工藝研究L8T紅軟基地
1、工藝選擇L8T紅軟基地
           根據(jù)目標肽的結(jié)構(gòu)、自身生產(chǎn)條件等考慮選用液相合成或固相合成工藝。L8T紅軟基地
   均需要提供:L8T紅軟基地
          化學反應式、工藝流程圖、操作過程等，對工藝參數(shù)（如投料量、反應條件、反應試劑）要有詳細的描述，包括對于多肽的修飾（例如二硫鍵的形成等）。L8T紅軟基地
2、起始原料、試劑的質(zhì)量控制L8T紅軟基地
氨基酸及其衍生物L8T紅軟基地
氨基酸及其衍生物的質(zhì)量標準一般應包括:L8T紅軟基地
性狀、熔點、比旋度、化學純度、色譜純度及光學純度、含量等，其中化學純度和光學純度的控制尤為重要。L8T紅軟基地
如果使用了特殊的氨基酸或其衍生物，申報資料中還應提供其合成工藝及結(jié)構(gòu)研究的相關資料。L8T紅軟基地
樹脂L8T紅軟基地
采用固相合成方法制備多肽，應提供樹脂的來源、質(zhì)量標準和檢驗報告，并對樹脂的摩爾取代系數(shù)、在不同溶劑中的膨脹系數(shù)、所用合成條件下的穩(wěn)定性情況、交聯(lián)度等予以說明。L8T紅軟基地
常用樹脂包括聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺和聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物等，應根據(jù)目標多肽C末端氨基酸的不同類型（如羧酸型、酰胺型等）選擇特定用途的樹脂，并說明選擇的依據(jù)。L8T紅軟基地
3、工藝的過程控制L8T紅軟基地
（1）反應終點監(jiān)控L8T紅軟基地
液相合成屬于常規(guī)有機合成，一般可采用色譜法(如TLC法、HPLC法)監(jiān)測；L8T紅軟基地
固相合成偶合反應的終點可采用茚三酮法、三硝基苯磺酸（TNBS）法和四氯苯醌等監(jiān)測。二硫鍵連接的終點可用Ellman試驗或HPLC法監(jiān)測。L8T紅軟基地
（2）中間體質(zhì)量控制L8T紅軟基地
液相合成：L8T紅軟基地
   縮合片段：比旋度、熔點和純度等進行控制。L8T紅軟基地
   較長序列的中間體：氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、質(zhì)譜、比旋度等。L8T紅軟基地
固相合成：一般無中間體分離過程。但如果多肽從樹脂上切割后還需進行后續(xù)反應，對中間體的質(zhì)量也要進行相應控制，同時還要進行相應的結(jié)構(gòu)研究。 L8T紅軟基地
4、分離和純化L8T紅軟基地
多肽純化的方法包括：L8T紅軟基地
重結(jié)晶、逆流分布、電泳、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、反相色譜等。L8T紅軟基地
常見的純化方法：凝膠柱脫鹽，制備型高效液相色譜純化。L8T紅軟基地
樣品的干燥方法：常用凍干法，如果多肽對溫度不敏感，也可采用室溫或高溫干燥。L8T紅軟基地
申報資料純化方法應包括：L8T紅軟基地
詳細的驗證性資料例如純化前后樣品的代表性色譜圖以說明純化效果。L8T紅軟基地
提供詳細的純化過程和相關的工藝參數(shù)。L8T紅軟基地
純化工藝的研究可結(jié)合質(zhì)量研究中雜質(zhì)分析方法的驗證進行。L8T紅軟基地
（二）結(jié)構(gòu)確證研究L8T紅軟基地
多肽結(jié)構(gòu)研究的主要目的：L8T紅軟基地
    是要說明其氨基酸組成，序列是否正確，多肽分子中如有半胱氨酸，應明確其狀態(tài)（氧化態(tài)或還原態(tài)），對含有多個半胱氨酸的多肽，應明確二硫鍵的正確連接位點。對于長肽，需要對其空間結(jié)構(gòu)（例如二級、三級結(jié)構(gòu)）進行研究。L8T紅軟基地
短肽：L8T紅軟基地
     元素分析、紅外光譜、核磁共振譜、氨基酸組成分析、質(zhì)譜等常見方法，氨基酸序列測定。L8T紅軟基地
中、長肽：L8T紅軟基地
   氨基酸組成，氨基酸序列分析。（Edman降解，質(zhì)譜：分子量及其序列信息，是對Edman降解的很好補充。）L8T紅軟基地
中、長肽的結(jié)構(gòu)研究中，盡管紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜等能夠提供的可供分析的信息有限，但在一些情況下，上述研究還應考慮進行。例如，在可獲得結(jié)構(gòu)確證對照品時，進行上述譜圖的對比測定，對于說明所研制產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)有重要意義；對于全新結(jié)構(gòu)的多肽，進行上述研究，也可為說明多肽結(jié)構(gòu)提供輔助信息，并為質(zhì)量研究和質(zhì)量標準的制訂提供信息。L8T紅軟基地
當多肽中含有非天然氨基酸及氨基酸衍生物時，結(jié)構(gòu)研究中應予以證明。此時，應在相應的研究中，考察這些非天然氨基酸及氨基酸衍生物的色譜行為。L8T紅軟基地
（四）質(zhì)量研究與質(zhì)量標準L8T紅軟基地
1、質(zhì)量研究L8T紅軟基地
原料藥的質(zhì)量研究L8T紅軟基地
研究項目一般包括：L8T紅軟基地
   外觀性狀、理化常數(shù)、鑒別、氨基酸組成分析、水分、反離子含量、純度、有機溶劑和反應試劑殘留量、生物學安全性檢查、含量和/或活性效價測定等。L8T紅軟基地
對于合成多肽藥物，除常規(guī)項目外，理化常數(shù)一般需要關注其比旋度、等電點（pI）、溶解性（主要為水和緩沖液中）等。L8T紅軟基地
氨基酸組成分析、反離子（例如三氟醋酸或醋酸根）含量、反應試劑殘留量（例如從樹脂上裂解多肽使用了氫氟酸，需要檢查氟化物殘留量）等，則需要在原料藥質(zhì)量研究中予以重視。L8T紅軟基地
相關肽檢查（或稱有關物質(zhì)檢查）：L8T紅軟基地
RP-HPLC，（HPIEC）、毛細管電泳技術，高效分子排阻色譜（HPSEC）、（PAGE）以及激光散射粒度測定等技術。L8T紅軟基地
有關物質(zhì)檢查的方法學驗證應能證明所采用的方法可以有效分離目標多肽與工藝雜質(zhì)（例如缺失肽等）、降解產(chǎn)物（例如二硫鍵交換或氧化產(chǎn)物等）、聚合物等。一般應考察兩種以上不同原理的方法，高效液相色譜法至少應包括一種梯度洗脫方法，并采用多肽粗品和強制降解試驗等對方法的專屬性等進行考察、對比，此外還應注意研究多波長檢測的結(jié)果并選擇合適的檢測波長等L8T紅軟基地
合成多肽因結(jié)構(gòu)特征不同于通常的小分子化學藥品，純度檢查有時難以從根本上有效控制產(chǎn)品安全性，需要進行必要的生物學安全性檢查（如過敏試驗、降壓物質(zhì)、升壓物質(zhì)、異常毒性等）以全面控制產(chǎn)品質(zhì)量、保證安全性。此外，根據(jù)產(chǎn)品具體情況，對于長肽，有時尚需進行免疫原性或抗原活性等生物特性的研究。L8T紅軟基地
含量測定L8T紅軟基地
          評價多肽質(zhì)量的重要指標之一，理化方法測定其含量時稱為“含量測定”，生物學方法或酶化學方法測定其效價時稱為“效價測定”。對于短肽，理化方法測得的含量可以反映其有效程度時，首選簡單、通用的含量測定方法；對于具有一定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮其活性的多肽，需進行生物學方法或酶化學方法測定藥物活性（效價）的研究，包括含量與活性的關系、相應的方法學驗證等。L8T紅軟基地
（2）制劑的質(zhì)量研究L8T紅軟基地
            合成多肽制劑的質(zhì)量研究基本思路和要求可參照《化學藥物質(zhì)量標準建立的規(guī)范化過程指導原則》、《化學藥物制劑研究指導原則》等相關內(nèi)容，根據(jù)合成多肽的具體特點，在原料藥質(zhì)量研究的基礎上，結(jié)合劑型特點、處方工藝以及臨床使用特點，重點研究所用輔料和制劑工藝對產(chǎn)品質(zhì)量的影響、制劑輔料和制劑產(chǎn)生的降解產(chǎn)物對檢測方法的影響以及與劑型相關的質(zhì)量要素。研究項目一般亦應包括性狀、鑒別、檢查（安全性、均一性、純度要求與有效性指標等）、含量或效價測定等幾個方面。L8T紅軟基地
2、質(zhì)量標準L8T紅軟基地
原料藥質(zhì)量標準應包括氨基酸組成、等電點、中長肽的肽圖等。L8T紅軟基地
合理可行的質(zhì)量標準應能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量以保證臨床用藥的安全性和有效性，并有效地控制藥品批間質(zhì)量的一致性。L8T紅軟基地
《化學藥物雜質(zhì)研究技術指導原則》。L8T紅軟基地
（五）穩(wěn)定性研究L8T紅軟基地
合成多肽藥物穩(wěn)定性研究的基本原則應遵循《化學藥物穩(wěn)定性研究的技術指導原則》的一般性要求。L8T紅軟基地
與一般化學藥物相比，多肽藥物的穩(wěn)定性較差。L8T紅軟基地
穩(wěn)定性研究應根據(jù)多肽藥物穩(wěn)定性的特點合理選擇試驗條件、考察項目。L8T紅軟基地
加速試驗和長期留樣試驗的試驗條件應依據(jù)藥物對溫度、濕度和光照等條件的敏感程度考察（影響因素試驗）基礎上選擇；考察項目除常規(guī)項目（例如原料藥的比旋度、有關物質(zhì)和含量等）外，根據(jù)具體情況，可能還需要考察其生物活性的變化。L8T紅軟基地
與其他化學藥物不同，多肽藥物可能具有一定程度的表面活性，有與直接接觸藥品的包裝材料和容器發(fā)生吸附等相互作用的可能，從而引起制劑效價、生物活性下降。例如有些多肽分子能夠與玻璃表面的硅醇基發(fā)生相互作用。因此，在包裝材料的選擇方面需注意其與多肽藥物相互作用的研究，有些情況下可選擇特殊處理后的包裝容器，如表面經(jīng)硅烷化處理的容器等。L8T紅軟基地
多肽藥物藥代動力學特點L8T紅軟基地
生物半衰期短 L8T紅軟基地
        蛋白多肽類藥物進入體內(nèi)后可以被酶迅速代謝降解，半衰期通常很短，如血管緊張素II的半衰期<l min，胰島素在人體半衰期<9 min，組織纖溶酶原激活物為26～55min。L8T紅軟基地
具有首關效應 L8T紅軟基地
       蛋白多肽類藥物直接口服給藥，在經(jīng)過胃腸道和肝臟時會被部分代謝，使得進入體循環(huán)的藥量減少。如胰島素首次經(jīng)過肝臟有40％ 一50％的藥量被清除。故早期蛋白多肽類藥物往往采用非口服給藥，如注射給藥、鼻腔給藥、眼部給藥等 但口服給藥是最方便的給藥方式，尤其適用于長期用藥，所以，研制口服蛋白多肽類藥物逐漸成為發(fā)展的主要趨勢。L8T紅軟基地
生物利用度低L8T紅軟基地
        由于蛋白多肽類藥物的生物半衰期短，加上胃腸道和肝臟的首關效應等原因，其生物利用度通常較低。特別是口服給藥，因其分子量大，不易被動轉(zhuǎn)運吸收，使其生物利用度更低，一般只有10％ 左右。L8T紅軟基地
影響蛋白多肽類藥物藥動學參數(shù)的主要因素L8T紅軟基地
結(jié)合蛋白的影響 L8T紅軟基地
       蛋白多肽類藥物會和體內(nèi)某些特異性蛋白結(jié)合。這些特異性的蛋白往往會在細胞水平上調(diào)節(jié)蛋白多肽類藥物的效能，并可影響這類藥物的藥動學行為，特別是可影響其體內(nèi)清除和體液分析。這些結(jié)合蛋白可以作為一種儲存庫使藥物的體內(nèi)存留時間延長，也可作為清除機制加速這類藥物的清除。L8T紅軟基地
對給藥方案依賴性　L8T紅軟基地
        給藥方案可影響蛋白類治療藥物的藥效動力學，特別是蛋白激素類，這些激素生理情況下的分泌具有生理節(jié)律性，外源性蛋白治療劑不同給藥速率和方式可產(chǎn)生不同的作用。L8T紅軟基地
蛋白的免疫原性　L8T紅軟基地
          象所有的蛋白那樣，蛋白類治療藥物亦具有免疫原性，從而可誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體。抗體除可中和蛋白藥物的生物活性外，還可影響蛋白藥物的體內(nèi)分布、代謝和排泄。L8T紅軟基地
內(nèi)源性干擾　L8T紅軟基地
        一個主要的影響因素是不少蛋白類治療藥物就是機體中存在的物質(zhì)，特別是蛋白激素，細胞因子等。這些內(nèi)源性成分對外源性蛋白的藥物動力學產(chǎn)生干擾，因而在闡明給予的外源性蛋白藥物的確切藥動學時，內(nèi)源性物質(zhì)的影響必須予以控制。L8T紅軟基地
分析方法L8T紅軟基地
生物檢定法L8T紅軟基地
        多肽類藥物的生物活性不僅取決于藥物的一級結(jié)構(gòu)，而且與二、三級結(jié)構(gòu)密切相關。生物檢定法用于研究該類藥物的藥動學的獨特性及檢定標記藥物的生物活性，主要有在體分析和離體分析兩大類。L8T紅軟基地
          在體分析法分析多肽類藥物在整體動物中引起的特異生物學反應；離體分析法通常用細胞體外培養(yǎng)技術，以細胞增殖、分化或細胞毒性為基礎，以細胞數(shù)的增減為量效指標。L8T紅軟基地
免疫學方法L8T紅軟基地
        多肽類藥物是一種抗原或配體（或受體），有相應的抗體或受體（或配體），用免疫學方法及受體配體結(jié)合法可定量測定其免疫活性或結(jié)合活性。L8T紅軟基地
          免疫學方法測定的是多肽的免疫活性而不是生物活性，不能同時測定代謝物，具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結(jié)果誤差，也易受內(nèi)源性物質(zhì)干擾。L8T紅軟基地
放射性同位素標記法L8T紅軟基地
       放射性同位素標記法是研究多肽類藥物的主要工具，分為外標法和內(nèi)標法。蛋白質(zhì)中如含有酪氨酸或賴氨酸等適宜的氨基酸，可用外標法（將標記物如125I以化學方法偶聯(lián)至完整蛋白質(zhì)中），常用的有氯胺T法；外標法不可行時可用內(nèi)標法（將標記3H，14C或35S等同位素的氨基酸加入生長細胞或合成體系中，獲得含同位素的多肽分子）。內(nèi)標法因操作復雜而少用。L8T紅軟基地
同位素標記示蹤法與其他分析手段的聯(lián)合檢測L8T紅軟基地
       同位素標記示蹤法與其他手段聯(lián)合包括十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）、三氯醋酸沉淀（TCA）、HPLC法。L8T紅軟基地
色譜分析L8T紅軟基地
        肽譜圖分析是控制多肽藥物質(zhì)量的重要手段。肽譜圖對每一種多肽藥物都是特征的、專一的，因此可鑒別多肽，預測其一級結(jié)構(gòu)特征。L8T紅軟基地
        肽譜分析根據(jù)多肽Mr大小和氨基酸的組成特點，將蛋白水解酶作用于特殊的肽鏈位點，將多肽裂解成較小片段，通過相應分離檢測手段得到特征性指紋圖譜。用于色譜分析的有HPLC、高效毛細管電泳法（HPCE）、凝膠電泳法等。L8T紅軟基地
核磁共振法L8T紅軟基地
       核磁共振法（nuclear magnetic resonance， NMR）主要用于核定多肽的微觀理化性質(zhì)，還可提供三維結(jié)構(gòu)信息，NMR譜檢測的某些指標可以反映多肽的生物功能特別是酶促反應動力學過程。L8T紅軟基地