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Western blot 實(shí)驗(yàn)技術(shù) 定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。 1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法 Western Blot基本原理 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。 Western Blot一般流程 SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳蛋白樣品的制備裂解液 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理： SDS 是一種離子性的界面活性劑，它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時(shí)，它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來，而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位)，而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之 SDS 後，由於 SDS 帶強(qiáng)負(fù)價(jià)，使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不足道，且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致 (charge density)，所以決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素 凝膠成份丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺  SDS 配膠的Tris緩沖液 TEMED 過硫酸銨(時(shí)間) Tris-甘氨酸電泳緩沖液 凝膠濃度與蛋白分離范圍 半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間。（小分子量蛋白） 濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中。（大分子量蛋白） 封閉脫脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封閉液（生物試劑公司提供） 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37℃一小時(shí)，4 ℃過夜。倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)， 37℃一小時(shí)，4 ℃過夜。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10min。MXG紅軟基地

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