這是一個關(guān)于臨床酶學檢驗技術(shù)介紹PPT，主要介紹了1.酶活性的國際單位定義。2.酶活性測定的連續(xù)監(jiān)測法和定時法的概念。3.連續(xù)監(jiān)測法的計算和方法設(shè)計。4.酶活性測定最適條件的概念和意義。5.ALT、AST、ALP、GGT、LD、CK測定參考方法原理和評價等等內(nèi)容。酶的概念：人衛(wèi)第六版 酶（enzyme）是由活細胞合成的、對其特異底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)，是機體內(nèi)催化各種代謝反應最主要的生物催化劑(biocatalyst)。 人衛(wèi)第七版 生物體內(nèi)的酶（enzyme）是對其特異底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)和核糖核酸，前者是是機體內(nèi)催化各種代謝反應最主要的催化劑。 酶促反應表示為： 底物：Subestrate：S 產(chǎn)物：Product：P 酶 ：Enzyme：E 酶的化學本質(zhì)： 絕大多數(shù)的酶是蛋白質(zhì)，稱這類酶為enzyme 具有催化功能的RNA被稱為核酶(ribozyme) 具有催化功能的DNA被稱為脫氧核酶(deoxyribozyme) 酶的研究歷史： 1926年J.B.Sumner首次從刀豆制備出脲酶結(jié)晶，證明其為蛋白質(zhì)，并提出酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)的觀點 1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑 1995年，Jack W. Szostak 研究室首先報道了具有DNA連接酶活性的DNA片段，稱之為脫氧核酶(deoxyribozyme) 臨床酶學 高診斷靈敏度 高診斷特異性 臨床酶學檢驗技術(shù) 酶活性測定 酶蛋白質(zhì)量測定 臨床酶學的歷史： 1908年Wohlgemuth用尿淀粉酶（AMY）診斷急性胰腺炎 1930s，LPS、ALP、ACP開始用于臨床——定時法 1950s，Karmen、La Due、Wroblewski等人建立了分光光度法，ALT、AST、CK、LD等酶活性測定應用于肝膽疾病、心臟疾病的診斷——連續(xù)監(jiān)測法 1970s，同工酶和酶蛋白質(zhì)量測定 1980s，同工酶亞型 酶的特性（一）化學本質(zhì)：除核酶、脫氧核酶以外，為蛋白質(zhì)（二）高效催化性（三）高度特異性（四）可調(diào)節(jié)性（五）不穩(wěn)定性 絕對特異性(absolute specificity)：只能作用于特定結(jié)構(gòu)的底物，進行一種專一的反應，生成一種特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，歡迎點擊下載臨床酶學檢驗技術(shù)介紹PPT哦。

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酶的概念：人衛(wèi)第六版 酶（enzyme）是由活細胞合成的、對其特異底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)，是機體內(nèi)催化各種代謝反應最主要的生物催化劑(biocatalyst)。 人衛(wèi)第七版 生物體內(nèi)的酶（enzyme）是對其特異底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)和核糖核酸，前者是是機體內(nèi)催化各種代謝反應最主要的催化劑。 酶促反應表示為： 底物：Subestrate：S 產(chǎn)物：Product：P 酶 ：Enzyme：E 酶的化學本質(zhì)： 絕大多數(shù)的酶是蛋白質(zhì)，稱這類酶為enzyme 具有催化功能的RNA被稱為核酶(ribozyme) 具有催化功能的DNA被稱為脫氧核酶(deoxyribozyme) 酶的研究歷史： 1926年J.B.Sumner首次從刀豆制備出脲酶結(jié)晶，證明其為蛋白質(zhì)，并提出酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)的觀點 1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑 1995年，Jack W. Szostak 研究室首先報道了具有DNA連接酶活性的DNA片段，稱之為脫氧核酶(deoxyribozyme) 臨床酶學 高診斷靈敏度 高診斷特異性 臨床酶學檢驗技術(shù) 酶活性測定 酶蛋白質(zhì)量測定 臨床酶學的歷史： 1908年Wohlgemuth用尿淀粉酶（AMY）診斷急性胰腺炎 1930s，LPS、ALP、ACP開始用于臨床——定時法 1950s，Karmen、La Due、Wroblewski等人建立了分光光度法，ALT、AST、CK、LD等酶活性測定應用于肝膽疾病、心臟疾病的診斷——連續(xù)監(jiān)測法 1970s， 同工酶和酶蛋白質(zhì)量測定 1980s，同工酶亞型 酶的特性（一）化學本質(zhì)：除核酶、脫氧核酶以外，為蛋白質(zhì)（二）高效催化性（三）高度特異性（四）可調(diào)節(jié)性（五）不穩(wěn)定性 絕對特異性(absolute specificity)：只能作用于特定結(jié)構(gòu)的底物，進行一種專一的反應，生成一種特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物 。 相對特異性(relative specificity)：作用于一類化合物或一種化學鍵。立體結(jié)構(gòu)特異性(stereo specificity)：作用于立體異構(gòu)體中的一種。 （一）米氏方程（二）酶促反應進程（三）動力學參數(shù)（四）酶偶聯(lián)反應 （一）米氏方程 1913年，德國化學家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學說對酶促反映的動力學進行研究，推導出了表示整個反應中底物濃度和反應速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。 （二）酶促反應進程 1.延滯期 是指酶促反應開始至達到最大反應速度所需要的時間 2.線性期 是指酶促反應速度保持恒定的時期，不受底物濃度的影響 3.非線性期 隨著反應時間的延長，底物消耗越來越明顯，酶促反應速度明顯下降，偏離線性而進入非線性期 　　　　　　酶促反應進程好似100m徑賽 （三）動力學參數(shù) 1.初速度(initial velocity)指在反應最初階段底物的消耗量很�。ㄒ话阍�5﹪以內(nèi)）時的反應速度，用v0來表示 2.最大反應速度(maximum velocity)指當酶的結(jié)合位點與底物結(jié)合飽和時的反應速度，通常用V或Vmax來表示 3.米氏常數(shù)（Michaelis constant，Km）指酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度，單位同底物濃度 （四）酶偶聯(lián)反應 Ex：待測酶 Ea：輔助酶 Ei：指示酶 　　　酶偶聯(lián)反應進程 1.預孵育期 2.延滯期 3.線性期 4.非線性期 （一）按血清酶的來源分 1.血漿固有酶 2.非血漿固有酶 ①外分泌酶 ②細胞酶 注：除凝血酶和纖溶酶外，血清酶與血漿酶基本一致 （二）按診斷特異性分 ①非器官特異酶 ②器官特異酶 　�。ㄈ�）血清酶的去路 　1.腎小球濾過從尿液中排出 　2.網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除 　3.血管內(nèi)失活或滅活 1.性別 2.年齡 3.飲食 4.運動 5.妊娠 1.酶合成異常 2.細胞內(nèi)酶的滲漏 3.酶進入血液的方式 4.其他 （一） 酶活性單位 1.慣用單位 2.國際單位：在特定條件下，1分鐘能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物（µmol/ min）的酶量為一個“國際單位” 3.Katal單位：即每秒鐘轉(zhuǎn)化1個摩爾底物（mol /s）的酶量 （二） 酶活性濃度 指單位體積樣品中的酶活性單位， 習慣用U/L來表示體液中酶活性即酶活性濃度（三）正常上限升高倍數(shù)（upper limits of normal， ULN)：是指用測得的酶活性結(jié)果除以參考范圍上限 　　以mg/Ｌ或µg/Ｌ來表示優(yōu)點： ①靈敏度高 ②特異性高 ③可測定無活性的酶 ④與酶活性測定一起，計算免疫比活性， 可能提供新的資料和信息 ⑤在同工酶測定中更有價值 （一）概念 　　　將酶與底物在特定條件（緩沖液、溫度等）下孵育，經(jīng)過一定時間后，用終止液終止反應，通過化學或生物化學的方法測出底物或產(chǎn)物的總變化量，除以時間即可計算出底物消耗速度（－d[S]/min）或產(chǎn)物生成速度（d[P]/min），將速度換算為µmol/ min便是以國際單位表示的酶活性。 （二）計算 （一）概念 　　　將酶與底物在特定條件（緩沖液、溫度等）下孵育，每隔一定時間（2s∼60s）連續(xù)測定酶促反應過程中某一底物或產(chǎn)物的特征信號的變化，從而計算出每分鐘的信號變化速率。 最適條件（optimum condition）的概念：　　　是指能滿足酶發(fā)揮最大催化效率所需的條件。 1.合適的底物和最適底物濃度 2.理想的緩沖液種類和最適離子強度；反應液的最適pH 3.最適反應溫度 4.合適的輔因子、激活劑濃度；酶偶聯(lián)反應還需要確定指示酶和輔助酶的用量 5.合理的測定時間，延滯期應盡量短暫并有足夠的線性期 6.合適的樣品與反應試劑的比例；足夠的檢測范圍 7.盡量去除各種抑制劑 底物選擇的原則是： ①選擇Km最小的底物 ②要有足夠的溶解度 ③酶對底物特異性高 ④底物穩(wěn)定性好 ⑤較高臨床價值的底物 底物濃度的確定： ①單底物酶促反應：選擇[S]＝10Km～20Km，此時反應速度達到最大反應速度90.9% ～ 95.2% ②雙底物酶促反應：[A]/[B]之間的關(guān)系是一條雙曲線，有無數(shù)組數(shù)據(jù)。采取最經(jīng)濟原則。F（一般選90%或95%） 緩沖液種類的選擇原則： ①盡量使用活性緩沖液 ② pKa與測定pH比較接近，有足夠的緩沖容量 ③純度高，不含有抑制酶活性的雜質(zhì) ④溫度依數(shù)性小 ⑤對酶有穩(wěn)定作用 緩沖液離子強度的確定：離子強度越高，電解質(zhì)干擾酶和底物結(jié)合，酶活性將逐步下降，能滿足緩沖容量的要求即可。 ①大多數(shù)酶活性測定的離子強度在0.1mmol/L左右 ② ALP用AMP緩沖液，離子強度達到0.9mmol/L，有磷酸基團接受體作用 ③GGT用高濃度的雙甘肽有�；�接受體作用 常用的緩沖液： N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES） N，N’-雙（2-乙磺酸）哌嗪（PIPES）三羥甲基氨基甲烷（Tris）二乙醇胺（DEA）三乙醇胺（TRA） 2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP） 在1986年以前IFCC推薦酶活性測定的溫度是30℃ 2002年IFCC正式發(fā)表了“37℃下檢測酶催化活性濃度的IFCC一級參考方法操作手冊和參考制品認可系統(tǒng)” 目前基本無異議，確定37℃為酶活性測定溫度 ①脫輔基酶的酶活性恢復——預孵育期 ② EDTA——絡(luò)合重金屬離子 ③巰基酶需巰基試劑做激活劑　　反復實驗法確定用量 ①延滯期的確定原則是多觀察幾例濃度不等、病理情況不同的標本，選擇延滯期最長者作為確定值。 ②線性期的確定 線性期的確定與酶濃度的可測上限與非線性度有關(guān)。 ③計算非線性度，按最小二乘法的計算要求，讀數(shù)次數(shù)應不少于4次，讀數(shù)間隔按一般儀器要求30 s就足夠了，線性期在2min以上即可。 　樣品量與反應液總量的比例與方法檢測的靈敏度和檢測上限有關(guān)，與測定誤差也有關(guān) ①樣品/試劑越大可測上限越小，靈敏度越高，K值越小。1：10 ～1：100之間，1：30左右比較合適（CHE為特例，1：601 ） ②改變樣品/試劑是改變K值最簡單的方法， K值一般確定在2000 ～ 5000之間 ③可測上限的確定與臨床樣品的分布和臨床意義有關(guān)，有些儀器具有線性擴展功能 ①最常見的抑制劑有產(chǎn)物的抑制、底物的抑制，分析器材或試劑中的重金屬及體液中的藥物等造成的抑制。 ②采取的措施：選用高純度的原料、高純凈水、器材干凈，在反應液中加入金屬螯合劑，甚至可以引入一個副反應來去除產(chǎn)物的抑制作用等。 （一）儀器 　　　待測物的摩爾吸光系數(shù)與儀器波長的準確性、帶寬、比色杯透光性有關(guān)。K值的設(shè)置還需考慮稀釋體積、比色杯的光徑、副波長等因素影響（二）校準物（三）實驗參數(shù) （四）副反應的干擾 同一種屬中由不同基因或等位基因編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化作用，但其分子構(gòu)成、空間構(gòu)像、理化性質(zhì)、生物學性質(zhì)以及器官分布或細胞內(nèi)定位不同的一組酶稱為同工酶（isoezyme）凡酶蛋白結(jié)構(gòu)不同的同工酶稱為原級同工酶，而將經(jīng)加工或修飾后的同工酶稱為次級同工酶或酶多種形式 某些同工酶從組織進入體液后在蛋白酶作用下降解成不同的亞型（isoform） 原理：　　　由于各型同工酶的一級結(jié)構(gòu)或空間構(gòu)象不同，形狀也不同，因而帶電性質(zhì)不同，在電場中的電泳遷移率不同，使各型同工酶分離，然后用酶催化性質(zhì)選擇合適的顯色系統(tǒng)使區(qū)帶呈色評價：　　　優(yōu)點是選擇合適的電泳條件可獲得同工酶譜的全貌但缺點是其顯色系統(tǒng)不可能是所有同工酶的最適條件，而且定量也比較困難只是一種半定量的方法　　　酶與體內(nèi)的白蛋白、免疫球蛋白等復合物形成“矯作物” 常用的顯色系統(tǒng)有： ①重氮試劑染料：ALP、GGT同工酶的測定 ②電子傳遞染料：脫氫酶反應或脫氫酶偶聯(lián)的指示反應產(chǎn)生NAD（P）H，其中H+ 經(jīng)酚嗪甲酯硫酸鹽（PMS）傳遞，交給四氮唑鹽生成不溶性有色的甲臜（formazan，音z�。┗�合物。LDH同工酶的測定 原理：　　　免疫抑制法原理是利用某一亞基的特異性抗體與同工酶中對應的亞基特異結(jié)合而抑制其活性；化學抑制法是利用一定濃度某些化學試劑選擇性抑制某類同工酶；分別測定抑制前后的酶活性，間接計算出各類同工酶的活性。評價：　　　免疫抑制法優(yōu)點是抑制特異性高；缺點是需要制備抗體，測定成本高�；瘜W抑制法往往存在待測同工酶同時被抑制或其他同工酶抑制不徹底的缺點。 原理：　　　利用各型同工酶對熱的穩(wěn)定性差異的原理來測定同工酶。如堿性磷酸酶同工酶分為四型：腸型、生殖細胞型、胎盤型和非特異組織型。非特異組織型是在酶蛋白合成后，經(jīng)過不同形式的修飾和加工，形成的肝型、膽型、腎型、骨骼型等酶的多種形式�！　　「餍蛯�熱穩(wěn)定性：胎盤型>小腸型>其他型。若經(jīng)65℃15min的樣品預處理后只留下胎盤型同工酶。評價：　　　因特異性較差而較少使用。 原理：　　　利用糖鏈親和劑凝集素如麥胚凝集素（WGA）、刀豆凝集素（ConA）等與同工酶結(jié)合率的不同，對某型同工酶加以分離后進行測定�！　　�ALP骨型同工酶與WGA有較高的親和力，結(jié)合后形成沉淀，總酶活性減去上清液中未結(jié)合部分的酶活性就是骨型同工酶的活性。評價：　　　因特異性較差而較少使用。 1.測定谷氨酸 以酶電極法作代表，因需特殊儀器不適合臨床檢驗 2.測定丙酮酸 ①以賴氏法為代表的定時法 ②以IFCC推薦法為代表的連續(xù)監(jiān)測法 ③偶聯(lián)丙酮酸氧化酶法 1. α-酮戊二酸的用量 2.內(nèi)源性丙酮酸和GLDH的干擾 3.添加5’-磷酸砒哆醛 4.兩個指示酶 5.預孵育期長 比色法連續(xù)監(jiān)測法熒光法化學發(fā)光法 1.緩沖液和pH 2.巰基激活物 3.腺苷酸激酶的干擾和消除 4.EDTA的作用 5.樣品保存 1.以布氏（Bodansky）法為代表：β-甘油磷酸鈉做底物 2.以金-阿（King-Armstrong）法為代表：磷酸苯二鈉做底物 3.以皮-勞（Bessey-Lowery-Brock）法為代表：人工合成底物：磷酸對硝基酚二鈉鹽（PNPP） 1. AMP緩沖液 2.底物有一定自身水解作用 1. L-γ-谷氨酰-α（β）-萘胺做底物，催化生成的α（β）-萘胺與重氮試劑生成紅色化合物。 2. γ-L-谷氨酰對硝基苯胺（GNA）做底物，催化生成的對硝基苯胺在堿性環(huán)境下呈黃色，可以連續(xù)監(jiān)測。 3. 3-羧基-γ-L-谷氨酰對硝基苯胺（GCNA）做底物，催化生成的2-硝基-5-氨基苯甲酸在堿性環(huán)境下呈黃色，可以連續(xù)監(jiān)測。 1. 若反應溫度37℃時最適pH則為7.70 2. 5-氨基-2-硝基苯甲酸在410nm的摩爾消光系數(shù)為7.96 ×103（pH為7.70） 3. 樣品體積分數(shù)0.0909 1.一類方法是利用正向反應（L→P），以乳酸為底物，測定反應中NAD+的還原速率。分為定時法和連續(xù)監(jiān)測法 2.另一類方法是利用逆向反應（P→L），以丙酮酸為底物，測定反應中NADH的氧化速率。為連續(xù)監(jiān)測法 1. 37℃時最適pH為9.4，使用Tris緩沖液顯然不合適，而改用N-甲基-D-葡糖胺做緩沖液 2. 在各類乳酸鹽中，乳酸鋰首選。關(guān)于NAD+應選擇游離酸型與鋰鹽的混合型（游離酸：鋰鹽=1：5） 3. LD4和LD5對冷不穩(wěn)定，故樣品不宜冰箱存放 4. M和H亞基的理化性質(zhì)相差懸殊，很難兼顧 1.一類是以天然淀粉為底物的測定方法：水解前后粘度或濁度；測產(chǎn)物葡萄糖；淀粉與某些活性染料呈色的；碘遇直鏈淀粉呈蘭色碘淀粉比色法曾一度作為臨床最常用的方法 2.另一類方法是以人工合成的麥芽寡糖苷為底物的測定方法，與天然底物相比，最突出的優(yōu)點是底物的結(jié)構(gòu)和分子量確定 1. HEPES緩沖系統(tǒng)隨著pH升高PNP的摩爾消光系數(shù)會加大 2. α-葡萄糖苷酶對底物有緩慢的水解作用 3.多功能α-葡萄糖苷酶 1.一類是以乙酰膽堿酯做底物，常用的底物有氯化乙酰膽堿、碘化乙酰膽堿，生成產(chǎn)物乙酸造成pH下降，然后通過以下方法測定①pH差示法 ②pH指示劑法 ③羥胺比色法 2.第二類是以碘化乙酰硫代膽堿做底物，測定方法有①產(chǎn)物硫代膽堿與5-巰代-2-硝基苯甲酸（DTNB）生成黃色產(chǎn)物5-硫代硝基苯甲酸（5-TNBA），可以連續(xù)監(jiān)測吸光度的變化②硫代膽堿使黃色的高鐵氰化鉀還原為無色，連續(xù)監(jiān)測405nm的吸光度下降速度來計算出膽堿酯酶的活性 1.一類是以天然淀粉為底物的測定方法：水解前后粘度或濁度；測產(chǎn)物葡萄糖；淀粉與某些活性染料呈色的；碘遇直鏈淀粉呈蘭色碘淀粉比色法曾一度作為臨床最常用的方法 2.另一類方法是以人工合成的麥芽寡糖苷為底物的測定方法，與天然底物相比，最突出的優(yōu)點是底物的結(jié)構(gòu)和分子量確定 1. CHE是血清固有酶，酶含量高，若反應速率超過酶反應線性范圍需將樣品稀釋后測定。 2.從酶動力學進程分析，采用雙試劑，試劑1中的DTNB先與血清孵育可以消除干擾物，再用底物啟動酶促反應可以得到較好的線性期。 1. 根據(jù)酶是蛋白質(zhì)和生物催化劑這兩大特性，酶濃度的定量可以分別用酶蛋白質(zhì)量或酶催化活性來表示。酶催化活性測定方法簡便、快速、經(jīng)濟，是酶濃度的定量的主要手段。 2. 酶催化活性是用酶促反應的反應速度來表示，檢測速度的方法分為定時法和連續(xù)監(jiān)測法，目前連續(xù)監(jiān)測法已經(jīng)逐步取代了定時法。 3. 連續(xù)監(jiān)測法按原理來分可分為色素原底物、脫氫酶指示系統(tǒng)、氧化酶指示系統(tǒng)等。 4. 酶催化活性是一種酶濃度相對定量的方法，與測定方法、測定條件、原料來源、儀器狀態(tài)、分析參數(shù)、校正品等多種因素有關(guān)，各實驗室應按最適條件的原則選擇方法和使用，力求檢測結(jié)果具有可比性。 5. 至今IFCC已建立ALT、AST、CK、LD、GGT、ALP測定的參考方法和參考物質(zhì)，也有AMY、CHE、LPS測定的推薦方法。 6. 酶活性參考物質(zhì)不是標準品，必須與測定系統(tǒng)其他要素一起使用才有價值。 1. 酶活性測定的溯源性要求尤其重要，酶活性測定標準化工作任重而道遠。 2. 自動生化分析儀的發(fā)展與方法學的發(fā)展是相輔相成的，若有熒光檢測器能自動連續(xù)監(jiān)測，也許會有新的診斷酶用于臨床，也必將使方法學得到進一步發(fā)展。 3. 隨著免疫學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的同工酶及其亞型用于臨床，這仍然是診斷酶學發(fā)展的方向。酶試劑分析、工具酶、抗體酶、固相酶等其他領(lǐng)域的研究將使酶學駛向快速發(fā)展之路。DrR紅軟基地