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第四章 核酸雜交技術 目 錄 第一節(jié) 核酸分子雜交的概念 一、核酸探針 二、分子雜交信號檢測 第二節(jié) 經典的核酸分子雜交技術 一、固相雜交 二、液相雜交 目 錄 核酸分子雜交(molecular hybridization of nucleic acid) 核酸分子雜交：單鏈的核酸分子在合適的條件下，與具有堿基互補序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過程。 核酸分子雜交技術：利用核酸分子雜交檢測靶序列的一類技術稱核酸分子雜交技術。 核酸分子雜交技術目前應用廣泛，是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列片段的有力工具。 第一節(jié) 核酸分子雜交的概念 2、融解溫度 (Melting Temperature， Tm)定義：在DNA熱變性時，其A260的升高達最大值一半時的溫度。 重點提示 分子雜交：指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則經過退火處理，形成異質雙鏈的過程。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。 一、核酸探針 核酸探針指能與靶核酸序列發(fā)生堿基互補雜交，并能由其標記被特異性檢測的核酸分子。 1. DNA探針 最常用的核酸探針 2.RNA探針 3.寡核苷酸探針 （二）探針的長度 （三）核酸探針的標記 不同標記類型探針的比較： 2.探針標記方法的選擇 二、分子雜交信號檢測 （一）放射性標記探針檢測 2.液體閃爍計數法 （二）非放射性標記探針的雜交檢測 化學發(fā)光是指化學反應中釋放的能量以光的形式發(fā)射出來形成檢測信號。 化學發(fā)光酶免疫技術中目前常用的酶有堿性磷酸酶及辣根過氧化物酶 發(fā)射光線的強度反映了酶的活性，反應了雜化分子的量。 采用發(fā)色體檢測的最大益處是可同時檢測一個以上的雜化分子 每種探針分別用不同的報告基團如生物素、熒光素和地高辛標記并同時與固定在濾膜上的核酸雜交 采用不同的鏈霉抗生素或抗體-酶和相應底物組合 核酸分子雜交分類 分子雜交技術一般過程 ☆ 探針制備及標記（同位素或非同位素） ☆ 待測核酸樣品制備（分離，純化） ☆ 雜交（液相，固相，原位雜交） ☆ 雜交后處理（去掉非特異雜交分子） ☆ 顯示結果（顯色，發(fā)光，放射自顯影） ☆ 結果分析 固相雜交： （一）反向點雜交 （二）Southern印跡雜交 （二）Southern印跡雜交 Southern雜交的應用 Northern雜交應用 二、液相雜交 液相雜交 三、原位雜交 （一）基本操作步驟： 雜交前準備：保持細胞形態(tài)結構、保存核酸、增加組織的通透性、減低背景。 雜交：使探針與細胞中的把序列結合。 雜交后處理：鹽溶液的漂洗，以減少背景。 顯示：根據核酸探針標志物的種類選擇相應的檢測系統(tǒng)。  （二）原位雜交的應用 1. 細胞遺傳學分析 產前診斷 生殖醫(yī)學中的應用 血液疾病中染色體易位的檢測 實體瘤研究 2. 比較基因組雜交 3. 基因圖譜繪制 4. 病原學檢測 核酸分子雜交技術類型 一、探針的選擇 二、探針的標記方法 三、探針的濃度 四、雜交率 五、雜交溫度 六、雜交的嚴謹性 七、雜交反應時間 八、雜交促進劑ABF紅軟基地

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