這是基因工程菌ppt，包括了工程菌的來源和應用，何謂基因工程，工程菌的獲得，工程菌應具備的條件，工程菌的應用，工程菌的培養(yǎng)，工程菌培養(yǎng)的特點，工程菌外漏的防范，基因工程產品的提取和精制等內容，歡迎點擊下載。

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第十四章 基因工程菌的發(fā)酵 第一節(jié) 工程菌的來源和應用 一、何謂基因工程 基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設計十分類似的方法，根據人們的意愿，主要是在體外進行基因切割、拼接和重新組合，再轉入生物體內，產生出人們所期望的產物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。 基因工程的核心技術是DNA的重組技術。 重組即利用供體生物的遺傳物質或人工合成的基因，經過體外或離體的限制酶切割后與適當的載體連接起來形成重組DNA分子，然后在將重組DNA分子導入到受體細胞或受體生物構建轉基因生物，該種生物就可以按人類事先設計好的藍圖表現出另外一種生物的某種性狀。 除DNA重組技術外，基因工程還應包括基因的表達技術，基因的突變技術，基因的導入技術等。 基因工程一般分為4個步驟： 取得符合人們要求的DNA片段，這種DNA片段被稱為“目的基因”； 將目的基因與質粒或病毒DNA連接成重組DNA； 把重組DNA引人某種細胞； 把目的基因能表達的受體細胞挑選出來。 二、工程菌的獲得 確定目的產物。 找出產該產物的細胞。 將細胞破碎后提純出全部信使RNA。這些信使中包含了該細胞內表達的所有蛋白質的合成信息。 利用基因擴增技術（PCR），找出所需的目的基因。 將目的基因連接到設計好的質粒載體，形成了重組DNA分子。 將重組后DNA分子引入到受體細胞內，然后選擇合適的培養(yǎng)條件使細胞繁殖。根據選擇性標記，從菌落中篩選出目的基因的重組(工程)菌。 三、工程菌應具備的條件 發(fā)酵產品是高濃度、高轉化率和高產率的，同時是分泌型菌株。 菌株能利用常用的碳源，并可進行連續(xù)發(fā)酵。 菌株不是致病株，也不產內毒素。 代謝控制容易進行。 能進行適當的DNA重組，并且穩(wěn)定，重組的DNA不易脫落。 四、工程菌的應用 1，基因藥物 紅細胞生成素 胰島素 干優(yōu)素 乙肝疫苗 生長激素 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 2，其它發(fā)酵產品 酶制劑 氨基酸（蘇氨酸、色氨酸） 抗生素 第二節(jié) 工程菌的培養(yǎng) 就生產流程而言，從發(fā)酵到分離、純化目標產物，工程菌和常規(guī)微生物并無太多的差異。但工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產過程中表現出不穩(wěn)定性，以及安全性等問題，使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點。 一、安全問題 關于基因工程的社會問題，必須提到它的潛在危險性。經過重組的菌和質粒一旦用于工業(yè)化生產，就不可避免地進入自然界。這些菌能間接地危害人體健康，使治療藥物失去效用，污染環(huán)境等。因此，安全問題是極其重要的。 1974年，提出了DNA重組實驗具有潛在生物危險性的問題。后來，制定了有關DNA重組實驗的準則，其目的是保證實驗的安全和推動重組DNA的研究。 這些準則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據對實驗安全度的評定，采用物理密封(P1~P4)和生物學密封(B1和B2)兩種方法。 物理密封是將重組菌封閉于設備內，以防止傳染給實驗人員和向外界擴散。實驗規(guī)模在20L以下時，物理密封由密封設施、實驗室設計和實驗注意事項組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級，數字越大，密封水平越高。 生物學密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時用不能轉移至其它活細胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統，可以防止重組菌向外擴散。按密封程度分B1和B2級，B2級的密封要求最嚴格。 二、工程菌培養(yǎng)的特點 工程菌工業(yè)化培養(yǎng)中，產物的產率往往比實驗室培養(yǎng)規(guī)模為低。 為提高工程菌體表達效率，需采取適當措施，提高重組DNA在受體細胞內的拷貝數及促進表達產物自細胞內向細胞外分泌。 工程菌體的原宿主通常是某些培養(yǎng)物質(如某種氨基酸或維生素等)的缺陷型，有些基因工程細胞生產過程亦產生某些抑制細胞生長的代謝物。在培養(yǎng)過程中應考慮控制培養(yǎng)液營養(yǎng)成分及其濃度，同時采取措施，消除抑制細胞生長的代謝物，以保證細胞正常生長。 三、工程菌的培養(yǎng) 工程菌的營養(yǎng)控制 質粒穩(wěn)定性 重組質�？截悢档目刂萍氨磉_效率 1，底物濃度的控制 在基因工程茵培養(yǎng)過程，至少要遵循PI級物理防護的規(guī)定，因此必需進行菌體的高密度培養(yǎng)。 從生物安全性考慮，培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營養(yǎng)缺陷型突變株。 2，質粒穩(wěn)定性 （1）質粒不穩(wěn)定的類型 分離性不穩(wěn)定：這是由于在細胞分裂過程中質粒缺失分配到子細胞中而導致整個質粒丟失。 結構性不穩(wěn)定：這是由于重組質粒DNA發(fā)生缺失、插入或重排引起的質粒結構變化。 （2）影響質粒穩(wěn)定的因素 與質粒穩(wěn)定有關的基因及質粒結構自身對其穩(wěn)定性的影響 宿主對質粒穩(wěn)定的影響 質�？截悢� 重組質粒的表達對質粒穩(wěn)定性的影響 （3）使質粒穩(wěn)定的措施 組建合適載體 選擇適當宿主 施加選擇壓力 抗生素添加法 抗生素依賴變異法 營養(yǎng)缺陷型法 控制基因過量表達 控制培養(yǎng)條件 （4）質粒保持率 為考察質粒穩(wěn)定性，在此引入質粒保持率Fn的概念，Fn表示分批培養(yǎng)中細胞分裂n次后，培養(yǎng)液中基因工程細胞數與總細胞數的比值，即 假定在分批培養(yǎng)過程中，細胞在對數生長期每次分裂時，其質粒丟失率為P，則Fn為 3，表達效率及質�？截悢悼刂� 在工程菌培養(yǎng)過程中，表達效率與質�？截悢涤嘘P。在質粒穩(wěn)定基礎上，應盡可能提高細胞內質�？截悢�。 在工業(yè)生產中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達到提高拷貝數目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細胞負荷，此時拷貝數較低，而比生長速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質�？截悢翟黾樱�目的基因產量提高。 第三節(jié)工程菌分批培養(yǎng)動力學 對于質粒脫落性不穩(wěn)定，細胞在分裂時丟失質粒的概率為p， 則 第四節(jié) 培養(yǎng)裝置與產物的提取 工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的培養(yǎng)方法類似。在進行以工業(yè)化為目的的DNA重組實驗，以及為生產異種基因產物而培養(yǎng)重組菌時，當然應采用簡便易行的培養(yǎng)系統。現在多半使用大腸桿菌為宿主，而在一般的通氣攪拌罐中大腸桿菌能生長良好。 一、培養(yǎng)罐 作為基因重組體的培養(yǎng)裝置，與一直沿用的通氣攪拌培養(yǎng)罐要有區(qū)別，即不僅要防止外部微生物侵入罐內，還必須采用不使培養(yǎng)物外漏的培養(yǎng)裝置。按實驗準則，可把這類密閉型通氣攪拌式培養(yǎng)罐劃分為操作液量20L以上和20L以下兩種。 現今使用的微生物培養(yǎng)裝置，按其滅菌法又可分兩類。 一是在高壓滅菌器中進行培養(yǎng)基及培養(yǎng)罐的滅菌，罐本身通常是玻璃制的，容量在10L以下的居多； 另一類是20L以上的培養(yǎng)罐，一般為不銹鋼制品，多采用通新鮮蒸氣進行滅菌。 二、工程菌外漏的防范 首先應了解培養(yǎng)微生物在普通通氣攪拌罐中可能發(fā)生外漏的部位和操作。歸納起來有： 排氣， 機械密封， 接種， 取樣， 培養(yǎng)后的滅菌(通入濕熱蒸氣)， 排液(輸至下一工序)。 1，排氣 2，機械密封 考慮培養(yǎng)液外漏的情況，培養(yǎng)基因工程菌時，以用上部攪拌的雙機械密封為好。 3，取樣 普通培養(yǎng)罐的取樣管道在取樣時會流出樣品。取樣后對樣品管道滅菌時，未滅菌的培養(yǎng)液污水被排至排水管內。對此，必須采取措施，如用取樣工具進行取樣。此法可在培養(yǎng)液不接觸外界的條件下取樣。 4，培養(yǎng)后的滅菌 培養(yǎng)后對培養(yǎng)液和管道等進行滅菌時，一開始流出的末滅菌排水有可能存在活的重組菌。取樣、排液的管道中能產生這類排水，因此，一定要另行安裝排水管并與廢液滅菌貯槽等相連接，以便排放污水。 5，接種 向罐內直接接種的方法是不安全的。簡單的安全接種法是將種子瓶與培養(yǎng)罐以管相連接后，用無菌空氣加壓壓入的方法。另一種方法是先把種子液在安全柜內移至供接種用的小罐內，再將其與培養(yǎng)罐連接，用蒸汽對連接部分滅菌后，把種子罐中的種子液接入培養(yǎng)罐內。 6，排液 培養(yǎng)后要將培養(yǎng)液輸送至貯罐等下一道工序，這時也有可能產生氣溶膠和重組菌的擴散。安全的方法是在培養(yǎng)開始前就將排液口與下段工序相連接并進行滅菌，這樣培養(yǎng)一結束即可直接輸送培養(yǎng)液。如果排液口未與下段工序相連那就應與連結廢液滅菌罐的排水管道相接，這樣就安全了。 三、培養(yǎng)罐的管道布局 下圖表示重組菌培養(yǎng)罐(P2、P3級)的整體流程圖。重組菌培養(yǎng)罐中，凡有可能外漏重組菌的部分都與排污管道相連。圖中所示的管路能分離并排出污染重組菌的污水。 四、基因工程產品的提取和精制 傳統的發(fā)酵產品和基因工程產品在提取和精制上的不同，主要表現在下列兩方面： 傳統發(fā)酵產品多為小分子(工業(yè)用酶除外，但它們對純度要求不高，提取方法較簡單)，其理化性能，如平衡關系等數據都已知，因此放大比較有根據；相反，基因工程產品都是大分子，必要數據缺乏，放大多憑經驗。 基因工程產品大多處于細胞內，提取前需將細胞破碎，增添了很多困難。 另外，對于基因工程產品，還應注意生物安全(biosafety)問題，即要防止菌體擴散，特別對前面幾步操作，一般要求在密封的環(huán)境下操作。例如用密封操作的離心機進行菌體分離時，整個機器處在密閉狀態(tài)，在排氣口裝有一無菌過濾器，同時有一根空氣回路以幫助平衡在排放固體時系統的壓力，無菌過濾器用來排放過量的氣體和空氣，但不會使微生物排放到系統外。OSr紅軟基地

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