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葉綠素含量的測定 一.實驗原理 根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。 根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質濃度C和液層厚度L成正比，即A＝αCL.式中：α比例常數(shù)。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，α為該物質的吸光系數(shù)。各種有色物質溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質在不同波長下的吸光度而求得。 如果溶液中有數(shù)種吸光物質，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的總和。就是吸光度的加和性。如欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。 植物葉綠素含量測定----丙酮提取法 高等植物光合作用過程中利用的光能是通過葉綠體色素(光合色素)吸收的。葉綠體色素由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。葉綠體色素的提取、分離和測定是研究它們的特性以及在光合中作用的第一步。葉片葉綠素含量與光合作用密切相關，是反眏葉片生理狀態(tài)的重要指標。在植物光合生理、發(fā)育生理和抗性生理研究中經(jīng)常需要測定葉綠素含量。葉綠素含量也是指導作物栽培生產(chǎn)和選育作物品種的重要指標。 葉綠素不溶于水，溶于有機溶劑，可用多種有機溶劑，如丙酮、乙醇或二甲基亞砜等研磨提取或浸泡提取。葉綠色素在特定提取溶液中對特定波長的光有最大吸收，用分光光度計測定在該波長下葉綠素溶液的吸光度(也稱為光密度)，再根據(jù)葉綠素在該波長下的吸收系數(shù)即可計算葉綠素含量。 利用分光光計測定葉綠素含量的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即當一束單色光通過溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。其數(shù)學表達式為： A=Kbc 式中： A為吸光度；K為吸光系數(shù)；b為溶液的厚度；c為溶液濃度。 葉綠素a、b的丙酮溶液在可見光范圍內的最大吸收峰分別位于663、645nm處。葉綠素a和b在663nm處的吸光系數(shù)（當溶液厚度為1cm，葉綠素濃度為g·L-1時的吸光度）分別為82.04和9.27；在645nm處的吸光系數(shù)分別為16.75和45.60。根據(jù)Lambert-Beer定律，葉綠素溶液在663nm和645nm處的吸光度（A663和A645）與溶液中葉綠素a、b和總濃度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，單位為g·L-1），的關系可分別用下列方程式表示： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） Ca=12.7 A663—2.59 A645 (3) Cb=22.9 A645—4.67 A663 (4) Ca十b＝20.3 A645—8.04 A663 (5) 從公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要測得葉綠素溶液在663nm和645nm處的吸光度，就可計算出提取液中的葉綠素a、b濃度和葉綠素總濃度（a+b）。 所測定材料的單位面積或單位重量的葉綠素含量可按下式進行計算： 葉綠素含量（mg·g-1或mg·dm-2）= C×V A×1000 式中：C為葉綠素濃度（mg·L-1）或mg·dm-2）；V為提取液總體積（ml）；A為取樣鮮重（g）或取樣面積（dm-2）。 80%丙酮提取液中色素濃度計算公式: (濃度單位：mg/L） Ca= 12.21A663 – 2.81A646 Cb= 20.13A646 – 5.03A663 CT = Ca+ Cb = 17.32A646 – 7.18A663 Cx.c =(1000A470 –3.27 Ca – 104 Cb)/229 植物組織中單位鮮重各色素的含量(mg.g/L) 葉綠體色素的含量= 色素的濃度(mg.L-1) ×提取液體積(L) ×稀釋倍數(shù) 樣品鮮重(或干重，面積，g或m2) 二. 試劑與材料 2.1 試劑： 丙酮、石英砂、碳酸鈣 2.2材料： 菠菜的新鮮葉片。 2.3 儀器與器皿： 分光光度計、臺秤、剪刀、研缽、移液管、漏斗、大試管 三. 實驗步驟 葉片洗凈、吸干、去大葉脈 ↓ 稱0.5g葉用丙酮研磨 ↓ 勻漿過濾（用80%丙酮洗研缽及殘渣，合并濾液） ↓ 濾液用80%丙酮定容至10mL ↓ 適當稀釋后測A645、A663 四. 結果計算 4.1 結果計算 C(mg/L)×提取液總量（L）×稀釋倍數(shù) Chl = (mg/g葉) 材料鮮重（g） 4.2 比較分析不同植物的葉綠素含量差異及同種植物在不同生長環(huán)境下Chla/Chlb差異。 五. 注意事項 注意葉綠素一定要提干凈，避免造成測定誤差 葉綠素初提液體積不要太多，以免浪費試劑，如果濃度太高可進行適當稀釋 注意分光光度計的規(guī)范使用 六. 思考題 為什么植物在不同生長環(huán)境下其 Chl含量有差異？ Chla /Chlb有何適應意義？DJf紅軟基地

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