這是分子生物學(xué)ppt模板，包括了基因工程，基因工程的基本概念，工具酶，載體，重組DNA技術(shù)的基本原理，重組DNA技術(shù)的基本過程，核酸的分子雜交，聚合酶鏈反應(yīng)，DNA芯片技術(shù)，基因診斷和基因治療等內(nèi)容，歡迎點(diǎn)擊下載。

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分子生物學(xué)常用技術(shù)及其應(yīng)用 第一節(jié) 基因工程 一基因工程的基本概念 DNA重組——不同來(lái)源的DNA分子通過末端共價(jià)連接而形成重新組合的DNA分子的過程。 基因工程——采用人工方法將不同來(lái)源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過程。 生物技術(shù)——包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、、細(xì)胞工程。 克隆——通過無(wú)性繁殖所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。 二、工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶：能從中間有選擇性地切割DNA分子特異序列。 DNA連接酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶多核苷酸激酶 堿性磷酸酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 三、載體 載體必須符合以下幾點(diǎn)要求： （1）能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并具有較高的拷貝數(shù) （2）容易進(jìn)入宿主細(xì)胞 （3）具有多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶單一的酶切位點(diǎn) （4）容易從宿主細(xì)胞中分離純化 （5）有容易被識(shí)別篩選的標(biāo)志 常用的載體包括：質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒、病毒 五、重組DNA技術(shù)的基本過程 （一）制備目的基因和載體； （二）DNA的重組； （三）重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 （四）DNA重組體的篩選和鑒定 （五）DNA重組體的 擴(kuò)增和表達(dá) （一）目的基因的 制備： 目的基因的篩選和分離可采用以下方法進(jìn)行： 1．直接從染色體DNA中分離： 僅適用于原核生物基因的分離，較少采用。 2．人工合成： 根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。 3．從mRNA合成cDNA： 采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補(bǔ)DNA（cDNA），除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補(bǔ)DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法通常可得到可表達(dá)的完整基因。 4．從基因文庫(kù)中篩選： 將某一種基因DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪�，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G文庫(kù)(genomic DNA library)。 將某種細(xì)胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(kù)(cDNA library)。C-文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性。 5．利用PCR合成： (聚合酶鏈反應(yīng)） 如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，在體外合成目的基因。 （二）目的基因與載體連接(DNA的重組）  主要通過DNA連接酶和雙鏈DNA粘性末端序列互補(bǔ)結(jié)合。 1、粘性末端連接 利用同種限制性內(nèi)切酶切開載體和DNA分子，能產(chǎn)生相同的粘性末端，在T4連接酶作用下遍可互補(bǔ)。 2、同聚物加尾連接 在酶的催化下人為在DNA鏈3‘末端添加多聚脫氧單核苷酸，制造粘性末端。 3、平末端連接 在 T4 DNA連接酶的作用下，直接連接DNA平端末端，效率較低。 4、人工接頭連接 在平端DNA末尾加上人工合成的具有限制性DNA內(nèi)切酶的DNA片段，再用內(nèi)切酶作用產(chǎn)生粘性末端。 （三）將外源性DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 常用的方法兩種： 1、轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化——指將質(zhì)�；蚱渌�外源性DNA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。 包括CaCl2制備感受態(tài)宿主細(xì)胞、法電穿孔法、顯微注射法、基因槍法等 2、感染 感染——以噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)胞或病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖的過程。 用滅活的噬菌體或病毒的蛋白質(zhì)外殼包裹重組的DNA分子，使其進(jìn)如宿主細(xì)胞。 （四）目的基因的篩選和鑒定 常用的方法包括：遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR、核苷酸序列測(cè)定、DNA限制內(nèi)切酶圖譜分析法等。 遺傳學(xué)法：載體經(jīng)常帶有抗藥基因，利用含有該藥物的培養(yǎng)基直接分離。 分子雜交法：利用32P標(biāo)記的探針與被檢對(duì)象進(jìn)行雜交鑒定。 免疫學(xué)法：利用特異性抗體與基因表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合的方法。 （五）克隆基因的表達(dá) 不同的目的基因在真核和原核表達(dá)體系中表達(dá)結(jié)果不同。 真核細(xì)胞可用于表達(dá)原核基因 原核細(xì)胞表達(dá)的真核基因產(chǎn)物還需要進(jìn)一步加工處理，如甲基化、糖基化、折疊 六、基因工程在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究 疾病的診斷和基因治療 生產(chǎn)基因工程藥物：既可改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)，提高產(chǎn)量，也可用于新蛋白類藥物的生產(chǎn)。 制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：可用于藥物蛋白生產(chǎn)、器官移植 人類基因工程組計(jì)劃 蛋白質(zhì)工程：通過基因工程改變蛋白質(zhì) 第二節(jié) 核酸的分子雜交 核酸分子雜交——依據(jù)兩條單核苷酸鏈之間的堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性的原理，用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針，檢測(cè)待測(cè)樣品中是否存在與其互補(bǔ)的同源核苷酸序列的方法。 一、核酸分子雜交的基本原理 探針核酸分子與變性的被檢核酸分子復(fù)性，通過堿基互補(bǔ)的原則，形成雜交分子。 探針必須帶有標(biāo)記，可用于定性和定量分析 （二）核酸分子雜交的基本方法 Southern印跡雜交 待測(cè)核酸是DNA片段，是DNA與DNA雜交，指將酶切并經(jīng)電泳分離的DNA片段固定在載體上，與探針進(jìn)行雜交。 Northern印跡雜交 待測(cè)核酸是RNA片段，指將待測(cè)RNA經(jīng)分離后固定在載體上，與探針進(jìn)行雜交。 斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交 直接將變性核酸固定在載體上，用探針進(jìn)行雜交。優(yōu)點(diǎn)是一張膜同時(shí)可用多種不同探針檢測(cè) 原位雜交 直接用探針和細(xì)胞內(nèi)的核酸進(jìn)行雜交 三、探針的特征 （一）探針的特征 1、要帶有標(biāo)記物 2、應(yīng)是單鏈 3、具有高度的特異性 4、探針長(zhǎng)段不一，短探針雜交速率快且特異性強(qiáng) 5、標(biāo)記的探針應(yīng)具有高度的靈敏性、穩(wěn)定、標(biāo)記方法簡(jiǎn)便、安全 （二）探針的種類與制備 1、基因組DNA探針——直接從基因組分離 2、cDNA探針——通過逆轉(zhuǎn)錄生成 3、寡核苷酸探針——人工聚合成 4、RNA探針——轉(zhuǎn)錄生成 （三）探針的標(biāo)記物 放射性標(biāo)記物：32P、35S、3H、125I、131I 非放射性標(biāo)記物：生物素、地高辛、熒光素、酶 （四）標(biāo)記方法 體內(nèi)標(biāo)記法：將標(biāo)記物摻入培養(yǎng)基 體外標(biāo)記法：化學(xué)法或酶法 第三節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng) polymerase chain reaction 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） ——體外高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增 目的基因或DNA片段的技術(shù)。 一、PCR 的基本原理 其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間等，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增 二、過程（經(jīng)典操作過程）1、高溫變性（DNA模板變性） 與體內(nèi)DNA解鏈過程不同，PCR中作為模板的雙鏈DNA是通過95℃左右的高溫使其發(fā)生變性，形成單鏈DNA 2、低溫退火（模板與引物退火） PCR通常需要兩條寡核苷酸鏈作為DNA合成時(shí)的引物（primer），這兩個(gè)引物分別與待擴(kuò)增模板DNA的目標(biāo)片段兩端的序列互補(bǔ)。在降低溫度的過程中（一般為70-75 ℃ ，通過控制退火條件，引物就能準(zhǔn)確地與擴(kuò)增區(qū)域的兩端配對(duì)。 ⑴引物短，不易纏繞； ⑵設(shè)計(jì)的引物是與模板DNA兩端序列互補(bǔ)； ⑶引物的量遠(yuǎn)大于模板分子的量，引物與模板DNA形成雙鏈的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA分子自身的復(fù)性。 3、適溫延伸（72 ℃） 在PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體系中游離的單核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按堿基配對(duì)的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補(bǔ)的復(fù)制鏈。 熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán) 每一循環(huán)后的模板均比前一循環(huán)增加1倍。理論上講，擴(kuò)增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的，即n個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)量為2n拷貝。而實(shí)際上，PCR的擴(kuò)增倍數(shù)為（1+X）n，X為擴(kuò)增效率，平均為75% 盡管PCR擴(kuò)增DNA非常有效，但目的DNA序列的指數(shù)擴(kuò)增并不是一個(gè)無(wú)限制的過程。 在正常的反應(yīng)條件下，經(jīng)30次循環(huán)之后，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，就會(huì)出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng) (Plateau) ，產(chǎn)物的量不再增加。 “平臺(tái)效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能、模板DNA的拷貝數(shù)、dNTP濃度等多種因素。 RT—PCR 以mRNA為原始模板的PCR，亦稱逆轉(zhuǎn)錄PCR。 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42 ℃進(jìn)行，隨后將反應(yīng)混合物加熱至95 ℃5min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，取2ul反應(yīng)產(chǎn)物，按DNA為模板的PCR反應(yīng)步驟，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。 第四節(jié) DNA芯片技術(shù) 綜合了分子生物學(xué)、微電子學(xué)、微加工和計(jì)算機(jī)等學(xué)科知識(shí) 本質(zhì)：在固定的玻片等載體上的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，芯片上每平方厘米可排列成千上萬(wàn)生物分子，能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)核酸，并獲取樣品中的有關(guān)信息。 一、DNA芯片技術(shù)的概念和主要類型 DNA芯片技術(shù)——指將大量已知寡核苷酸或DNA探針（不標(biāo)記）按特定的排列方式固化在固相支持物（多用計(jì)算機(jī)硅芯片）表面，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，與標(biāo)記的特異的單鏈DNA或RNA（待測(cè)樣品）分子雜交形成雙鏈，通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，得出樣品分子的數(shù)量和序列信息。 DNA芯片主要類型 原位合成芯片 才用光介導(dǎo)和壓電打印等技術(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片 DNA微集陣列 將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片 二、DNA芯片技術(shù)的基本原理與方法 DNA芯片技術(shù)工作流程主要包括： 芯片制備——關(guān)鍵 樣品的準(zhǔn)備與標(biāo)記 雜交 信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析處理 （一）、芯片的制備 1、支持物的預(yù)處理 支持物包括實(shí)性材料和膜性材料 實(shí)性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等 實(shí)性材料需要進(jìn)行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基等活性基團(tuán)，并在表面用光敏材料保護(hù)。 膜性材料包括聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等 膜性材料則要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸。 2、原位合成芯片的制備 兩種方法：光介導(dǎo)原位合成法、壓電打印合成法 利用排列組合的原理，在一塊載體的不同位置合成不同的寡核苷酸片段 3、DNA微集陣列的制備 包括制備探針、打印、探針固化三個(gè)步驟 （二）樣品的準(zhǔn)備 包括分離純化、擴(kuò)增和標(biāo)記 （三）分子雜交 一般30分鐘內(nèi)完成 （四）檢測(cè)分析 根據(jù)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度分析樣品含量及樣品結(jié)合的探針類型，最后分析樣品核苷酸序列。 三、DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用（自學(xué)） DNA序列測(cè)定 突變及多態(tài)性分析 基因表達(dá)分析 基因組研究 基因診斷 藥物研究與開發(fā) 第五節(jié) 基因診斷和基因治療 基因診斷——以DAN或RNA為診斷材料，DNA反映基因的存在狀態(tài)、RNA反映基因的表達(dá)狀態(tài)，通過檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常。 常用的方法：包括核酸分子雜交、PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)、限制性內(nèi)切酶酶譜分析、DNA序列測(cè)定、DNA芯片技術(shù) 基因治療——指以正常基因矯正、替代缺陷基因，或從基因水平調(diào)控細(xì)胞中缺陷基因的表達(dá)的一種治療疾病的方法。 基本過程： 1、選擇制備目的基因 2、選擇基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體 3、選擇靶細(xì)胞 4、轉(zhuǎn)移基因 5、外源基因表達(dá)的篩選 6、回輸細(xì)胞到體內(nèi)CkW紅軟基地

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