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分子生物學(xué) 第一章 緒論 第一節(jié) 分子生物學(xué)的定義和研究?jī)?nèi)容 一、定義 分子生物學(xué)是從分子水平研究生命現(xiàn)象及其規(guī)律的一門(mén)新興、前沿學(xué)科。 它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及其在信號(hào)傳遞中的作用為研究對(duì)象，其發(fā)展非常迅速。 分子生物學(xué)以其嶄新的觀(guān)點(diǎn)和技術(shù)向其他學(xué)科的全面滲透，推動(dòng)了許多學(xué)科向分子水平發(fā)展。 使細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和生態(tài)學(xué)由原來(lái)的經(jīng)典學(xué)科變成了生命科學(xué)的真正前沿科學(xué)，形成了一系列交叉學(xué)科，如分子遺傳學(xué)、分子生態(tài)學(xué)、分子免疫學(xué)、分子病毒學(xué)、分子病理學(xué)、分子腫瘤學(xué)和分子藥理學(xué)等。分子生物學(xué)是生命科學(xué)的核心前沿。 不同種屬生物的表現(xiàn)形式多種多樣和千姿百態(tài)，但是，生命活動(dòng)的本質(zhì)卻是高度一致的。例如絕大多數(shù)生物遺傳取決于DNA；除少數(shù)例外，遺傳密碼在整個(gè)生命世界中都是一致的。又如核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系以及蛋白質(zhì)的有序合成，也表現(xiàn)出高度一致性。 因此，分子生物學(xué)開(kāi)辟了研究各種不同種屬生物的生命現(xiàn)象最基本、最重要的途徑。 分子生物學(xué)的發(fā)展為人類(lèi)認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象帶來(lái)了前所未有的機(jī)遇，也為人類(lèi)利用和改造生物創(chuàng)造了極為廣闊的前景。 由于生物化學(xué)、生物物理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物學(xué)及免疫學(xué)以及數(shù)學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和信息學(xué)等專(zhuān)業(yè)技術(shù)的滲透，分子生物學(xué)已發(fā)明和創(chuàng)造了一系列新的技術(shù)。 例如DNA及RNA的印跡轉(zhuǎn)移、核酸分子雜交、DNA克隆或重組DNA、基因體外擴(kuò)增、DNA 測(cè)序等等，以及研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)與功能的分析技術(shù)。 其中重組DNA(recombinant DNA)技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的核心。 重組DNA技術(shù)又稱(chēng)為基因操作(gene manipulation )、分子克隆(molecular cloning)、基因克隆(gene cloning) 或基因工程（gene engineering）等。 這些名詞彼此間存在某些微小的差別，在不同情況和不同條件下常常交換使用。 “基因操作”定義為：通過(guò)任何方法將細(xì)胞外構(gòu)建的DNA分子(或片段)插入病毒、質(zhì)�；蚱渌�載體系統(tǒng)，形成遺傳物質(zhì)的重新組合，使它們能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，并能在其中繼續(xù)擴(kuò)增。 而“重組DNA 技術(shù)”狹義上具“基因操作”相同的含義，但它涉及范圍更廣泛，甚至泛指分子生物學(xué)中與DNA水平研究有關(guān)的技術(shù)。 因此，分子生物學(xué)技術(shù)已成為推動(dòng)生物科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域向分子水平發(fā)展的重要工具或手段，也是服務(wù)于人類(lèi)和社會(huì)，推動(dòng)醫(yī)藥和工、農(nóng)業(yè)發(fā)展的強(qiáng)大動(dòng)力。 二、分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容 分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)方面。 1、核酸分子生物學(xué)： 主要研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能。 2、蛋白質(zhì)分子生物學(xué)： 主要研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。盡管人類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)的研究比對(duì)核酸研究的歷史要長(zhǎng)得多，但由于其研究難度較大，與核酸分子生物學(xué)相比發(fā)展緩慢。  3. 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)主要研究細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間信息傳遞的分子基礎(chǔ)。 第二節(jié) 分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史 一、生物遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn) 早在1868年，Miescher F從膿細(xì)胞中分離出細(xì)胞核，用稀堿抽提再加入酸，得到了一種含氮和磷特別豐富的物質(zhì)，當(dāng)時(shí)稱(chēng)其為核素(nuclein)。1872年，他又在鮭魚(yú)精子細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了大量的這類(lèi)物質(zhì)。由于這類(lèi)物質(zhì)都是從細(xì)胞核中提取出來(lái)的，而且又是酸性，故稱(chēng)其為核酸(nucleic acid)。 二、現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立 1950年Astbury WT在一次題為“Adventures in molecular biology”講演中首先使用“分子生物學(xué)”這一術(shù)語(yǔ)， 用以說(shuō)明它是研究生物大分子的化學(xué)和物理學(xué)結(jié)構(gòu)。 1953年Watson JD和Crick FH提出“DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)學(xué)說(shuō)”（生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)），是分子生物學(xué)創(chuàng)建的里程碑。 該學(xué)說(shuō)啟動(dòng)了分子生物學(xué)及重組DNA技術(shù)，開(kāi)創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論的黃金時(shí)代。 其主要進(jìn)展有： 1953年，Watson和Crick《Nature》雜志上發(fā)表一篇震動(dòng)生物學(xué)界的論文“脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)”。 Watson和Crick的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)學(xué)說(shuō)已被普遍地視為分子生物學(xué)發(fā)展的最主要里程碑，也是分子生物學(xué)及其技術(shù)的重要理論基礎(chǔ)。 1956年Kornberg， A.，首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶（生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）； 1957年，Hoagland MB等分離出tRNA，并對(duì)它們?cè)诤铣傻鞍踪|(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能提出了假設(shè)； 1958年，Meselson M及Stahl FW提出了DNA半保留復(fù)制模型； 1958年，Weiss SB及Hurwitz J等發(fā)現(xiàn)依賴(lài)于DNA的RNA聚合酶； 1961年Hall BD等用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補(bǔ)；這些工作使RNA轉(zhuǎn)錄合成的機(jī)制得以逐步闡明。 1963年，Holley RW 從酵母中提取丙氨酰轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNA）， 1965年，Holley測(cè)定了tRNA核苷酸序列(生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))。 1968年，Okazaki R（岡崎）等提出了DNA不連續(xù)復(fù)制模型； 20世紀(jì)70年代初獲得DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，并對(duì)真核DNA聚合酶特性作了分析研究。這些都逐漸完善了對(duì)DNA復(fù)制機(jī)制的認(rèn)識(shí)。 三、現(xiàn)代分子生物學(xué)的深入發(fā)展 (一)重組DNA技術(shù)的發(fā)明 1．基因克隆工具酶的發(fā)現(xiàn)： 1970年，Smith HO在微生物中發(fā)現(xiàn)一組目前稱(chēng)之為限制性核酸內(nèi)切酶的酶類(lèi)，簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶(restriction enzyme)。（生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)） Temin等從肉瘤病毒(一種逆轉(zhuǎn)錄病毒)中發(fā)現(xiàn)了一種逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)（生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)） 2．DNA片段的體外連接：1972年，Berg P和Jackson DA等首次將兩個(gè)不同生物體來(lái)源的DNA片段，在DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接(或重組)，產(chǎn)生了第一個(gè)重組DNA分子。 3．質(zhì)粒的構(gòu)建：1973年，Cohen S 構(gòu)建了第一個(gè)可用于 DNA 分子克隆的載體——質(zhì)粒（plasmid）。 4．核酸雜交技術(shù)：1969年，Pardue ML等首先建立了細(xì)胞原位雜交技術(shù)。1975 年，Southern EM發(fā)明一種印跡雜交技術(shù)，被稱(chēng)為 Southern 印跡或Southern轉(zhuǎn)移技術(shù)。 5．DNA序列分析技術(shù)：1977年，劍橋大學(xué)Sanger F等創(chuàng)建了雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列，與此同時(shí)，美國(guó)Maxam I和Gilbert W發(fā)明了化學(xué)裂解法或部分降解法測(cè)定DNA序列（化學(xué)獎(jiǎng)）。 6．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction，PCR) ： 1985年，Mullis K首創(chuàng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)技術(shù)（化學(xué)獎(jiǎng)）。該技術(shù)在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程，進(jìn)行體外“基因擴(kuò)增”。 (二) 分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展 由于分子生物學(xué)的廣泛滲透和應(yīng)用，反過(guò)來(lái)又推動(dòng)了重組DNA技術(shù)和分子生物學(xué)本身的發(fā)展。有關(guān)這方面的研究進(jìn)展事例不勝枚舉�，F(xiàn)僅就具有重大歷史意義、影響廣泛深遠(yuǎn)的主要事件簡(jiǎn)述如下。 1．癌基因的發(fā)現(xiàn)：1975年，Bishop JM和Vermus HE在Rous肉瘤病毒(一種逆轉(zhuǎn)錄病毒)中首次發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)癌基因－src。同時(shí)證明src基因不是Rous肉瘤病毒所固有、而是來(lái)自宿主細(xì)胞基因組，在所有小雞細(xì)胞中都有其同源副本。 2．基因診斷：1976年，Kan YW應(yīng)用分子雜交技術(shù)，用cDNA探針進(jìn)行溶液雜交，檢測(cè)α-珠蛋白基因有無(wú)缺失，首次成功地進(jìn)行了一例α珠蛋白合成障礙性貧血（又稱(chēng)為α-地貧）純合子胎兒(胎兒水腫)的產(chǎn)前診斷。這也是首例單基因遺傳疾病的基因診斷。 3．基因組文庫(kù)的建立： 1978年，Smithies O等建立了第一個(gè)人類(lèi)基因組文庫(kù)(genomic library)。 4．基因工程生產(chǎn)人胰島素： 1979年，Goeddel DV及其同事詳細(xì)報(bào)道了他們成功地用化學(xué)合成的人胰島素基因在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。隨后Eli Lilly公司在1982年獲準(zhǔn)銷(xiāo)售基因工程生產(chǎn)的胰島素。 5．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物： 1981年，Palmiter R和Brinster R利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)成功地建立第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立，為研究基因功能及遺傳病的基因治療提供了活體模型。 6. 人類(lèi)基因治療研究： 1990年4月，美國(guó)NIH的Blaese RM和Anderson WF 等首次將腺苷脫氨酶(ADA)基因?qū)�入至一位患�?yán)重復(fù)合免疫缺陷癥(SCID)的4歲小孩體內(nèi)，并取得一定療效，開(kāi)創(chuàng)了人類(lèi)基因治療（human gene therapy）的先河，并為20世紀(jì)90 年代以來(lái)基因治療研究蓬勃開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。 7．基因工程抗體技術(shù)的建立和發(fā)展： 人們利用細(xì)胞工程技術(shù)研制出多種單克隆抗體，為許多疾病的診斷和治療提供了有效的手段。 8．DNA芯片（基因芯片、生物芯片）技術(shù)： 是指將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ诠腆w支持物上，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。 （三）基因組研究的進(jìn)展 基因組（genome）是指一個(gè)物種遺傳信息的總和。 2001年2月11日，參加人類(lèi)基因組計(jì)劃的六國(guó)科學(xué)家、美國(guó)塞萊拉遺傳信息公司、美國(guó)《科學(xué)》雜志和英國(guó)《自然》雜志聯(lián)合宣布，繼科學(xué)家于2000年繪制成功人類(lèi)基因組工作框架圖之后，又繪制出了更加準(zhǔn)確、清晰、完整的人類(lèi)基因組圖譜，對(duì)人類(lèi)基因組的面貌有了新的發(fā)現(xiàn)。 人類(lèi)基因數(shù)量遠(yuǎn)比預(yù)計(jì)的少，人類(lèi)基因數(shù)量?jī)H有2.5～3萬(wàn)個(gè)左右，比以前估計(jì)的8萬(wàn)至10萬(wàn)個(gè)要少得多。 通過(guò)進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，男女可能存在巨大遺傳差異，男性染色體減數(shù)分裂的突變率是女性的兩倍。并找到了很多與遺傳病有關(guān)的基因，包括乳腺癌、遺傳性耳聾、中風(fēng)、癲癇癥、糖尿病和各種骨骼異常的基因。 (四)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究 1961年，Jacob F和Monod J最早提出操縱子學(xué)說(shuō)（生理醫(yī)學(xué)），打開(kāi)了人類(lèi)認(rèn)識(shí)基因表達(dá)調(diào)控的窗口。 從80年代開(kāi)始，人們逐步認(rèn)識(shí)到真核基因的順式調(diào)控元件與反式作用因子、核酸與蛋白質(zhì)間的分子識(shí)別與相互作用是真核基因表達(dá)調(diào)控的根本所在。 1981年，Altman S和 Cech TR同時(shí)發(fā)現(xiàn)了具有催化自我剪接活性的RNA，稱(chēng)之為ribozyme(核酶)（化學(xué)獎(jiǎng)），參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。 （五）小分子RNA研究進(jìn)展 1993年，Lee RC等發(fā)現(xiàn)線(xiàn)蟲(chóng)(C.elegans) lin-4基因編碼的小分子RNA，其長(zhǎng)度為22～61個(gè)核苷酸——反義RNA。 反義RNA能與lin-14 mRNA的3ˊ非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）反義互補(bǔ)結(jié)合，阻斷l(xiāng)in-14的翻譯，降低線(xiàn)蟲(chóng)早期發(fā)育階段lin-14蛋白的水平。 小干擾性RNA (small interfering RNA，siRNA)系21～25個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA，是長(zhǎng)雙鏈RNA (dsRNA)被細(xì)胞內(nèi)Dicer切割而成。 siRNA能誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)基因沉默，使那些與雙鏈RNA有同源序列的mRNA被降解，從而抑制了該基因的表達(dá)，這一現(xiàn)象稱(chēng)為RNA干擾（RNAi）。 （六）細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究 1957年，Sutherland EW發(fā)現(xiàn)了cAMP， 1965年又提出第二信使學(xué)說(shuō)，這是人們認(rèn)識(shí)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一個(gè)里程碑。 1977年，Ross EM等用重組實(shí)驗(yàn)證實(shí)G蛋白的存在和功能，G蛋白參與偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 從1957年到2000年從事分子生物學(xué)研究的科學(xué)家共獲得了31項(xiàng)諾貝爾獎(jiǎng)。 第三節(jié) 分子生物學(xué)與相關(guān)學(xué)科的關(guān)系 一、分子生物學(xué)與生物化學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系最為密切。兩者在我國(guó)教育部和科技部頒布的二級(jí)學(xué)科中，稱(chēng)為“生物化學(xué)與分子生物學(xué)”， 兩者并重。分子生物學(xué)雖然主要起源于生物化學(xué)，但它又不同于生物化學(xué)。 生物化學(xué)主要是從化學(xué)角度研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，它著重研究生物體內(nèi)各種生物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)化和新陳代謝。 分子生物學(xué)則著重闡明生命物質(zhì)（核酸與蛋白質(zhì)）的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)和基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。 二、細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系十分密切。 傳統(tǒng)上，細(xì)胞生物學(xué)主要是利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡研究細(xì)胞和亞細(xì)胞器的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能。細(xì)胞是由許多分子組成的復(fù)雜體系，探討組成細(xì)胞的生物大分子結(jié)構(gòu)與功能，比單純觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)更能深入了解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，因此，現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)越來(lái)越多地應(yīng)用分子生物學(xué)的理論和方法。 分子生物學(xué)則是從生物大分子的結(jié)構(gòu)入手，主要研究細(xì)胞整體反應(yīng)的分子機(jī)制。這反映了分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的交叉與融合，因此，產(chǎn)生了細(xì)胞分子生物學(xué)。 三、分子生物學(xué)與遺傳學(xué) 遺傳學(xué)是研究生物體遺傳和變異的科學(xué)。由于分子生物學(xué)的興起和發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)確認(rèn)生物遺傳信息攜帶者——基因就是DNA分子中的一個(gè)片段。 隨著分子生物學(xué)向遺傳學(xué)深入滲透，經(jīng)典遺傳學(xué)已進(jìn)入分子水平，因而誕生了分子遺傳學(xué)。 分子遺傳學(xué)是分子生物學(xué)和遺傳學(xué)相互交叉和滲透的結(jié)果。 分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究界線(xiàn)越來(lái)越模糊，但并不能說(shuō)分子遺傳學(xué)就等于分子生物學(xué)， 因?yàn)榉肿由�物學(xué)研究范圍更廣泛，幾乎包括生命科學(xué)各領(lǐng)域的分子水平研究。 四、分子生物學(xué)與生物技術(shù) 根據(jù)美國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)組織的定義：生物技術(shù)(biotechnology)是指“利用細(xì)胞和分子過(guò)程來(lái)解決問(wèn)題或制造產(chǎn)品的技術(shù)”。 現(xiàn)代生物技術(shù)主要包括兩個(gè)方面：基因（核酸）工程和蛋白質(zhì)（酶）工程。 這兩方面的生物技術(shù)又統(tǒng)稱(chēng)為分子生物學(xué)工程。 練習(xí)題（1） 一、名詞解釋 1、基因表達(dá)； 2、操縱子 3、反式作用因子； 4、啟動(dòng)子 5、Southern印跡雜交； 6、轉(zhuǎn)錄圖 7、生物信息學(xué)； 8、轉(zhuǎn)化 9、α-互補(bǔ)作用 ； 10、鋅指結(jié)構(gòu) 二、選擇題 1、 原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn) A 只有一種RNA聚合酶； B 基因以操縱子為基本單位進(jìn)行表達(dá)； C 轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程是偶聯(lián)進(jìn)行的； D 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要經(jīng)過(guò)加工修飾。 2、 DNA序列分析的主要應(yīng)用有 A 分析基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)； B 用于基因診斷和變異分析； C 由基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能； D 用于基因工程和蛋白質(zhì)工程相關(guān)分析。 3、 提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性的措施有 A 讓外源基因和宿主基因一起表達(dá)，形成融合蛋白； B 用酶消化載體； C 采用蛋白酶缺陷的突變菌株； D 表達(dá)分泌蛋白 三、 問(wèn)答題 1、簡(jiǎn)述PCR定點(diǎn)誘變法的原理與步驟 2、簡(jiǎn)述DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用 第二章 基 因 與 基 因 組 第一節(jié) 基 因 一、基因概念的起源 1865年，現(xiàn)代遺傳學(xué)的奠基人Mendel通過(guò)著名的豌豆雜交實(shí)驗(yàn)提出遺傳因子學(xué)說(shuō)。 1909年Johannsen將遺傳因子改稱(chēng)為基因，并提出基因型和表型的概念。 基因型(genotype)是逐代傳遞下去的成對(duì)因子的集合，因子中一個(gè)來(lái)源于父本，另一個(gè)來(lái)源于母本。 表型(phenotype)是指一些容易區(qū)分的個(gè)體特征的集合。 二、基因的化學(xué)本質(zhì) 1944年，美國(guó)的生物化學(xué)家Oswald Avery利用滅活的致病肺炎球菌提取DNA，與非致病肺炎球菌混合培養(yǎng)，使后者轉(zhuǎn)化為具有致病性的細(xì)菌，從而證實(shí)遺傳基因的本質(zhì)是DNA。 1952年，Alfred Hershey和Martha Chase利用病毒證實(shí)了DNA是遺傳物質(zhì)的攜帶者。 三、基因概念的發(fā)展與現(xiàn)代理解 Beadle和Tatum在1946年提出了“一個(gè)基因一種酶”的理論，并因此獲得1958年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 但是，對(duì)于具有多個(gè)亞單位的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，“一個(gè)基因一種酶”的假說(shuō)不夠完善。因此，人們提出了“一個(gè)基因，一條多肽鏈”的概念。 然而，在DNA分子中，除了編碼蛋白質(zhì)的基因外，還有編碼RNA的基因，如編碼tRNA 、rRNA 和snRNA的基因。因此，“一個(gè)基因，一條多肽鏈”的理論也不夠完善。 現(xiàn)代基因的定義為： 基因是核酸中貯存遺傳信息的遺傳單位，是貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息以及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列。 簡(jiǎn)單地說(shuō)， 基因——指導(dǎo)合成有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必需的全部DNA序列。 四、基因的結(jié)構(gòu) 從分子生物學(xué)的角度來(lái)說(shuō)，基因是DNA雙螺旋分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列。 在基因中用于編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列稱(chēng)為結(jié)構(gòu)基因（structure gene）， 結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)的側(cè)翼序列是不編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA片段，但含有基因的調(diào)控序列（圖2-1）。 圖2-1 基因結(jié)構(gòu)圖 （一） 結(jié)構(gòu)基因 大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因能通過(guò)信使RNA（messenger RNA，mRNA）進(jìn)一步編碼某種多肽或蛋白質(zhì)，但有少數(shù)結(jié)構(gòu)基因僅僅編碼一些具有特定功能的RNA，如轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA），核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）和其他小分子RNA。 結(jié)構(gòu)基因的DNA雙鏈都有作為模板鏈的可能。 攜帶生物信息（RNA序列信息）的那一條DNA鏈稱(chēng)為信息鏈或有意義鏈（sense strand）。 由結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄所得的RNA分子的核苷酸序列與其信息鏈的核苷酸序列一致，只是以U 取代了T。 5`-ACGTTCCGA-3` 3`-TGCAAGGCT-5` DNA ↓ 5`-ACGUUCCGA-3` RNA 對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的基因來(lái)說(shuō)，信息鏈又稱(chēng)為編碼鏈。 與信息鏈互補(bǔ)的DNA單鏈即為轉(zhuǎn)錄模板鏈（templates strand） 也稱(chēng)反意義鏈（antisense strand）�？梢杂脕�(lái)合成一條與模板DNA堿基互補(bǔ)的RNA鏈。 原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)的，其RNA合成后不需要經(jīng)過(guò)剪接加工。 大多數(shù)真核生物基因則在編碼區(qū)（coding region）內(nèi)含有非編碼的插入序列，因此被稱(chēng)為斷裂基因（interrupted gene） 斷裂基因——被非編碼序列隔斷了的不連續(xù)的結(jié)構(gòu)基因。其中編碼序列稱(chēng)為外顯子（exon），非編碼序列稱(chēng)為內(nèi)含子（intron）， 內(nèi)含子和外顯子一起轉(zhuǎn)錄，形成mRNA前體（precursor），但是在加工過(guò)程中被剪切掉，故內(nèi)含子不存在于成熟的mRNA序列中。經(jīng)過(guò)剪接，由全部外顯子連接而成的mRNA參與指導(dǎo)多肽鏈的合成。 在真核生物基因的外顯子與內(nèi)含子接頭處都有一段高度保守的一致序列（consensus sequence）。即內(nèi)含子5ˊ端大多數(shù)是以GT開(kāi)始，3ˊ端大多數(shù)是以AG結(jié)束，這稱(chēng)為GT-AG法則�？梢杂盟�作為真核基因中RNA剪接的識(shí)別信號(hào)。 (二) 非結(jié)構(gòu)基因——參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式作用元件 這類(lèi)調(diào)控元件是與結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)、具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄作用的特定DNA序列。由于他們和特定功能的基因連鎖在一起，因此稱(chēng)為順式作用元件（cis-acting element )。 包括：?jiǎn)��?dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、終止子等。 1. 啟動(dòng)子和上游啟動(dòng)子元件 （1）啟動(dòng)子 啟動(dòng)子（promoter）是指能被RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合，并能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程的DNA序列。 啟動(dòng)子具有方向性，位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游，本身并不被轉(zhuǎn)錄。 原核生物基因的啟動(dòng)子序列具有較高的同源性 。 真核基因啟動(dòng)子差別很大，但，幾乎所有已發(fā)現(xiàn)的真核生物基因的啟動(dòng)子都有TATA盒（TATA box），其核心序列是TATA（A/T）A（A/T），位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-25 bp左右處，TATA盒與一種被稱(chēng)為T(mén)ATA因子（轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合后，成為完整的啟動(dòng)子，精確地決定RNA合成的起始位點(diǎn)。 啟動(dòng)子的應(yīng)用：一個(gè)好的啟動(dòng)子具有重要應(yīng)用價(jià)值。 （2）上游啟動(dòng)子元件 上游啟動(dòng)子元件（upstream promoter elements）是TATA盒上游的一些特定的DNA序列。 反式作用因子可與這些元件結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)TATA因子與TATA盒的結(jié)合、RNA 聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率。 上游啟動(dòng)子元件包括CAAT盒、CACA盒及GC盒等。 CAAT盒含有5ˊ-GGNCAATCT-3ˊ核心序列。 GC盒含有5ˊ-CCGCC-3ˊ核心序列，兩者位于-70 bp和-120 bp之間，CACA盒的核心序列為GCCACACCC，位于上游-80 bp～-90 bp處。 2．反應(yīng)元件 一些受體被細(xì)胞外信息分子激活后，能與特異的DNA序列結(jié)合。被結(jié)合的DNA序列能調(diào)控基因的表達(dá)。這種能介導(dǎo)基因?qū)��?xì)胞外的信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)的DNA序列稱(chēng)為反應(yīng)元件（response elements）。 能與反應(yīng)元件結(jié)合的信息分子受體叫做反式作用因子，如糖皮質(zhì)激素受體。 糖皮質(zhì)激素→～受體（蛋白質(zhì)）活化＋特異的DNA序列（反應(yīng)元件）→調(diào)控基因表達(dá)。 反應(yīng)元件都具有較短的保守序列。 這些元件通常位于啟動(dòng)子附近和增強(qiáng)子內(nèi)。 糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件在增強(qiáng)子內(nèi)。 如熱休克反應(yīng)元件一般在啟動(dòng)子附近。 3．增強(qiáng)子 增強(qiáng)子（enhancer）是一段能增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，其中含有多個(gè)能被反式作用因子識(shí)別與結(jié)合的順式作用元件。反式作用因子與這些元件結(jié)合后能夠增強(qiáng)鄰近基因的轉(zhuǎn)錄。 增強(qiáng)子的作用： 主要通過(guò)改變DNA模板的螺旋結(jié)構(gòu)、為DNA模板提供特定的局部微環(huán)境；或?yàn)镽NA聚合酶和反式作用因子提供一種結(jié)構(gòu)，以幫助它們與某些順式元件相聯(lián)系等方式而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。 增強(qiáng)子在不同的基因中，其位置也不同。 增強(qiáng)子的作用無(wú)方向性和基因特異性，也不受基因之間距離遠(yuǎn)近的影響。 增強(qiáng)子是一種正調(diào)控序列。 增強(qiáng)子的應(yīng)用： 4、衰減子（沉默子） 1986年Maniatis等研究干擾素-β（IFN-β）基因轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)現(xiàn)了負(fù)調(diào)控序列。他們把這種對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起負(fù)調(diào)控作用的DNA序列稱(chēng)為衰減子，或沉默子（silencer）。 在真核細(xì)胞中，沉默子對(duì)成簇基因的選擇性表達(dá)起重要作用。 4．加尾信號(hào) 在結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè)保守的AATAAA序列。這個(gè)序列對(duì)于mRNA轉(zhuǎn)錄終止和加poly(A)尾是必不可少的。 AATAAA序列及其下游的一段GT豐富區(qū)或T豐富區(qū)共同構(gòu)成poly(A)加尾信號(hào)。 poly(A)加尾信號(hào)——由AATAAA序列及其下游的一段GT豐富區(qū)或T豐富區(qū)共同構(gòu)成的、能終止轉(zhuǎn)錄和添加多聚A尾的DNA序列。 mRNA轉(zhuǎn)錄到此部位后，會(huì)產(chǎn)生AAUAAA和GU（或U）豐富區(qū)。RNA轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子可以識(shí)別這種結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合，然后在A(yíng)AUAAA下游10~30個(gè)堿基的部位切斷RNA，并加上poly(A)尾。 第二節(jié) 基因組 一個(gè)物種的單倍體染色體數(shù)目及其所包含的全部遺傳物質(zhì)，稱(chēng)為該物種的基因組(genome)。 換句話(huà)說(shuō)，基因組是細(xì)胞或生物體中一套完整單倍體所含遺傳物質(zhì)的總稱(chēng)。 人類(lèi)基因組包括核基因組和線(xiàn)粒體基因組。 進(jìn)化程度越高的生物體其基因組越復(fù)雜。 一、病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能 病毒(virus)是一種具有比較原始的生命形態(tài)和生命特征的非細(xì)胞生物。完整的病毒顆粒包括衣殼蛋白和內(nèi)部的基因組DNA或RNA， （一）病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 1．不同病毒基因組大小相差較大 與細(xì)菌或真核細(xì)胞相比，病毒的基因組很小，但是不同的病毒之間其基因組相差甚大。如乙肝病毒（HBV）DNA只有3.2 kb，所含信息量也較小，只能編碼4種蛋白質(zhì)，而痘病毒的基因組有300 kb之大，可以編碼幾百種蛋白質(zhì)。 2. 不同病毒的基因組可以是不同結(jié)構(gòu)的核酸 病毒基因組可以由DNA組成，也可以由RNA組成。每種病毒顆粒中只含有一種核酸，DNA或RNA， DNA或RNA可以是單鏈的，也可以是雙鏈的，可以是閉環(huán)分子，也可以是線(xiàn)性分子。 3．單倍體基因組 所有病毒基因組都是單倍體，每個(gè)基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次。但逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組例外，它有兩個(gè)拷貝（其基因組由兩個(gè)相同的線(xiàn)狀正鏈RNA發(fā)展組成，稱(chēng)為二倍體RNA基因組）。 4．病毒基因組有連續(xù)的也有不連續(xù)的 。 DNA病毒基因組均由連續(xù)的DNA分子組成； 多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的核糖核酸鏈組成，但有些是由不連續(xù)的核糖核酸鏈組成，形成所謂分段基因組（segmented genome）。如流感病毒的基因組有8個(gè)節(jié)段。 5．基因有連續(xù)的和間斷的： 感染細(xì)菌的病毒（噬菌體）基因組與細(xì)菌基因組結(jié)構(gòu)特征相似，基因是連續(xù)的；而感染真核細(xì)胞的病毒基因組與真核生物基因組結(jié)構(gòu)特征相似，有的基因具有內(nèi)含子，基因是間斷的。 有些真核病毒的一部分，對(duì)某一個(gè)基因來(lái)說(shuō)是內(nèi)含子，而對(duì)另一個(gè)基因卻是外顯子。如SV40的早期基因即大T和小t抗原的基因都是從5 146位開(kāi)始，沿逆時(shí)針?lè)较蜻M(jìn)行，大T抗原基因進(jìn)行到 2 676位終止，而小t抗原進(jìn)行到4 624位終止。但是，從4 900到4 555之間有一段346 bp的片段是大T抗原基因的內(nèi)含子，而該內(nèi)含子是小t抗原的編碼基因（圖2-2） 。 6．病毒基因組的大部分是用來(lái)編碼蛋白質(zhì)的 病毒基因組的編碼序列大于90%，只有很小的一部分不編碼蛋白質(zhì)。 7．相關(guān)基因叢集 病毒基因組DNA序列中功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位，形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元。 8．基因重疊 重疊基因（overlapping gene）即同一段DNA片段能夠以?xún)煞N或兩種以上的閱讀方式進(jìn)行閱讀，因而可編碼2種或2種以上多肽。 (二)特殊病毒基因組介紹 1．乙型肝炎病毒： 2．逆轉(zhuǎn)錄病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬于RNA病毒。所有逆轉(zhuǎn)錄病毒的共同特點(diǎn)是能夠攜帶或編碼合成逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）。與其它RNA病毒復(fù)制不同的是，當(dāng)病毒感染細(xì)胞后，首先以自身的基因組RNA為模板，在RT催化下合成DNA中間體，即前病毒DNA（provirus DNA）。該DNA可以整合到宿主細(xì)胞染色體DNA上，并且能夠作為細(xì)胞基因組的一部分，隨細(xì)胞基因組復(fù)制和細(xì)胞分裂而傳遞下去；在宿主RNA聚合酶的作用下，原病毒DNA可以重新轉(zhuǎn)錄形成子代病毒RNA。 二、原核生物基因組 （一）原核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn) 1．基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成。 2．基因組中只有1個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。 3．具有操縱子結(jié)構(gòu)。 操縱子（operon）是指數(shù)個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)（多順?lè)醋樱�，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動(dòng)子和操縱基因）及其下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)構(gòu)成的基因表達(dá)單位。 ——由多順?lè)醋蛹捌湔{(diào)控序列構(gòu)成的基因表達(dá)單位。 4．結(jié)構(gòu)基因無(wú)重疊現(xiàn)象。 5．基因序列是連續(xù)的，無(wú)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄后不需要剪接。 6．編碼區(qū)和非編碼區(qū)（主要是調(diào)控序列）在基因組中約各占50%。 7．基因組多為單拷貝基因，重復(fù)基因很少。 8．具有編碼同功酶的基因（isogene）。 9．細(xì)菌基因組中存在可移動(dòng)的DNA序列，包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。 10．在DNA分子中具有多種功能識(shí)別區(qū)域，如復(fù)制起始區(qū)、復(fù)制終止區(qū)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)和終止區(qū)。 (二) 染色體外的遺傳物質(zhì)——質(zhì)粒 質(zhì)粒（plasmid） 是獨(dú)立于許多細(xì)菌及某些真核細(xì)胞（如：酵母等）染色體外的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子（cccDNA），是能夠獨(dú)立復(fù)制的最小遺傳單位。 盡管質(zhì)粒不是細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖所必需的物質(zhì)，但它所攜帶的遺傳信息能賦予細(xì)菌特定的遺傳性狀，如耐藥性質(zhì)粒（R質(zhì)粒）帶有耐藥基因，可以使宿主菌獲得耐受相應(yīng)抗生素的能力。 用途： （三）轉(zhuǎn)座（位）因子 轉(zhuǎn)座因子（元件）（transposable element） 即可移動(dòng)的基因成分，是指能夠在一個(gè)DNA分子內(nèi)部或兩個(gè)DNA分子之間移動(dòng)的DNA片段。 細(xì)菌的轉(zhuǎn)位因子（元件）包括插入序列、轉(zhuǎn)座子及可轉(zhuǎn)座的噬菌體。 （1）插入序列（insertion sequence，IS） IS是一類(lèi)較小的沒(méi)有表型效應(yīng)的轉(zhuǎn)位因子，長(zhǎng)度約700～2 000 bp，由一個(gè)轉(zhuǎn)位酶基因及兩側(cè)的反向重復(fù)序列（inverted repeat sequence，IR）組成。 （2）轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn） Tn是一類(lèi)較大的可移動(dòng)成分，除轉(zhuǎn)座基因外，至少含有一個(gè)與轉(zhuǎn)座無(wú)關(guān)并決定宿主菌遺傳性狀的其它基因，如抗藥基因。 （3）可轉(zhuǎn)座的噬菌體（transposable phage） 是一類(lèi)具轉(zhuǎn)座功能的溶源性噬菌體，包括Mu和D108等。 Mu噬菌體是大腸桿菌的一種溫和致突變噬菌體，是原核生物中第一個(gè)被闡明的可移動(dòng)因子。 噬菌體感染細(xì)菌后，通過(guò)整合作用，可插入細(xì)菌結(jié)構(gòu)基因內(nèi)，引起突變。 2. 轉(zhuǎn)位作用的機(jī)理 3. 轉(zhuǎn)位的遺傳效應(yīng) （1）轉(zhuǎn)位因子插入到結(jié)構(gòu)基因中可使基因序列發(fā)生改變，造成基因插入失活或功能改變；如果插入到非編碼區(qū)（調(diào)控區(qū)），可使下游基因不能轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)位因子的插入還可能引起基因突變、缺失和基因重排。 （2）由于轉(zhuǎn)位因子的縱向轉(zhuǎn)位插入，可產(chǎn)生新基因，如R質(zhì)粒的轉(zhuǎn)位因子轉(zhuǎn)位到染色體上，在該部位出現(xiàn)抗藥性基因，從而使抗藥性在菌群中得以傳播； 練習(xí)題（2） 名詞解釋 1、 基因表達(dá)調(diào)控 2、多順?lè)醋?3、DNA多態(tài)性 4、增強(qiáng)子 5、PCR 6、基因組作圖 7、蛋白質(zhì)工程 8、轉(zhuǎn)導(dǎo) 9、 cDNA文庫(kù) 10、 DNA指紋圖譜 二、選擇題 1、真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)有（ ） A 基因表達(dá)具有時(shí)間性和空間性； B 轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程分開(kāi)進(jìn)行； C 初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物要經(jīng)過(guò)加工修飾； D 也有超基因式操縱子結(jié)構(gòu)。 2、 提高PCR擴(kuò)增的特異性的途徑和方法有（ ） A 提高退火溫度、縮短退火和延伸時(shí)間； B 增加dNTP濃度 C 降低引物和酶的濃度； D 提高引物設(shè)計(jì)的特異性。 3、引物設(shè)計(jì)原則有（ ） A 特異引物長(zhǎng)度控制在20～30 bp； B G + C含量控制在40-60%； C 引物自身和引物之間沒(méi)有互補(bǔ)序列； D 引物3′不能進(jìn)行任何修飾。 三、問(wèn)答題 簡(jiǎn)述基因克隆的主要步驟 簡(jiǎn)述藍(lán)-白篩選的原理與方法 四、 計(jì)算題 現(xiàn)有OD260為0.5，堿基數(shù)為25的干粉DNA引物。請(qǐng)將它配制成濃度為10 pmol / µl的應(yīng)用液。如果50 µl PCR反應(yīng)體系需要40 pmol 引物，請(qǐng)問(wèn)25 µl 反應(yīng)體系需要這種濃度的應(yīng)用液多少微升？ty2紅軟基地

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