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臨床微生物學概論（第一部分） 主要內(nèi)容 標本采集 細菌的分離培養(yǎng)和鑒定 抗菌藥物敏感性試驗 正常菌群 在正常人體體表與外界相通的腔道：口腔、鼻咽腔、腸道、泌尿生殖道存在的多種微生物。 在機體免疫功能正常時對人體有益無害，屬人類正常微生物群或環(huán)境中通常不致病的微生物，因以細菌和真菌為主，故稱“正常菌群”。 正常菌群的存在是保持人體健康的重要因素 反映出在正常情況下，宿主、正常菌群和外界環(huán)境相互適應，保持平衡狀態(tài)。 病原微生物 病原微生物(pathogen)： 引起人類感染性疾病的微生物稱為病原微生物或致病微生物。 細菌：如痢疾志賀菌、腸桿菌科細菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌屬等 病毒：如單純皰疹病毒、巨細胞病毒、乙型肝炎病毒等 真菌：如念珠菌屬、曲霉屬、毛霉屬以及新型隱球菌等 其他：如支原體、衣原體、螺旋體 臨床常見的病原微生物 革蘭陽性菌： 葡萄球菌、溶血性鏈球菌、腸球菌 革蘭陰性菌： 需氧球菌： 腦膜炎和淋病奈瑟球菌、卡他莫拉菌 需氧桿菌： 不動桿菌、假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、嗜血桿菌 需氧和兼性厭氧：腸桿菌科細菌如大腸桿菌、肺桿、傷寒、志賀菌。 厭氧細菌：脆弱擬桿菌、痤瘡丙酸桿菌等 苛 養(yǎng) 菌 定義：是一類生長需要特殊營養(yǎng)物質(zhì)的細菌，與許多感染性疾病有關，其分離培養(yǎng)較為困難。 營養(yǎng)要求高 肺炎鏈球菌：培養(yǎng)基內(nèi)要加入血或血清 流感嗜血桿菌：X、V因子 比較嬌嫩、對干燥、對寒冷的抵抗力均較弱。 培養(yǎng)條件：5～10％CO2、35℃培養(yǎng)、24～ 48h 呼吸道其他快生長細菌的覆蓋使分離率非常低 厭 氧 菌 是一群專性厭氧，必須在無氧環(huán)境下才能生長繁殖的細菌。 根據(jù)能否形成芽胞，可將厭氧菌分成兩大類。 厭氧芽胞梭菌屬 無芽胞厭氧菌 厭氧芽胞梭菌屬：破傷風梭菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、肉毒梭菌、艱難梭菌 無芽胞厭氧菌：擬桿菌屬、梭桿菌屬、丙酸桿菌屬、消化鏈球菌屬等 標本的采集 抗菌藥使用前 正確的部位 正確的時間 足夠的數(shù)量 無菌的容器 特殊要求應在化驗單上注明 主要的臨床標本種類 標本類型 呼吸道標本 深部咳出痰、支氣管灌洗液 咽拭子、鼻氣管吸出液、氣管吸出液 尿液 血液 腦脊液 傷口、膿液 其它體液 胸水、心包液、引流液、腹水、滑囊液 標本的處理 涂片光鏡檢查 診斷病原最基本和快速的方法：腦脊液 直接形態(tài)學檢查 革蘭染色或特殊染色 分離培養(yǎng)和鑒定 動物接種 免疫學檢查 革蘭染色評估呼吸道標本是否合格？ 痰標本>10鱗狀上皮細胞/每低倍視野=拒收 細菌的分離培養(yǎng) 細菌的分離培養(yǎng) 按實驗室常規(guī)接種于培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件： 35℃ 24-48小時或 5%-10% CO2 35 ℃ 24 - 48小時 厭氧培養(yǎng) 具有特殊性狀的細菌 具有特殊性狀的細菌 細菌的鑒定 表型分類法 以細菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理、生化和血清學反應等細菌的表型為主要依據(jù) 分子生物學技術 基因診斷依據(jù)分析DNA的堿基組成，基因片段的大小，與比較DNA的同源性關系，從而分析 細菌DNA的親緣關系。 流感嗜血桿菌的衛(wèi)星現(xiàn)象 菌種鑒定—鑒定到種 根據(jù)純分細菌的形態(tài)、菌落特征，特征性的生化反應，選擇合適的細菌鑒定系統(tǒng)。 如手工的API條和半自動的ATB 腸桿菌科細菌：API 20E 非發(fā)酵革蘭陰性桿菌：API 20NE 葡萄球菌屬：Slidex Staph Plus、API Staph 鏈球菌屬：Slidex Strepto Kit、API Strep 奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬：API NH 厭氧菌：API 20A 菌種鑒定—鑒定到種 自動細菌鑒定/藥敏儀 VITEK 2 Compact BD Phoenix System MicroScan BIOMIC V3微生物鑒定系統(tǒng) BIOFOSUN微生物鑒定系統(tǒng) 鑒定到種 葡萄球菌？ 金黃色葡萄球菌！ 細菌鑒定和藥敏試驗快速化是未來的趨勢 質(zhì)譜檢測黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌 抗菌藥物和藥敏試驗 抗菌藥物是指具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學合成藥物。前者是真菌、放線菌、細菌等的代謝產(chǎn)物，后者是經(jīng)化學改造的半合成抗生素和化學合成藥物。 測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法稱為藥物敏感性試驗（Antimicrobial Susceptibility Testing， AST），簡稱藥敏試驗。 抗菌藥物敏感性試驗的意義 無法推測敏感或耐藥 病人個體化治療指南 提供經(jīng)驗治療的依據(jù) 建立當?shù)鼗驀�家處方政�?監(jiān)測流行病學趨勢 監(jiān)測細菌耐藥性 測試新抗菌藥物的抗菌活性 檢測新耐藥機制的方法 抗菌藥物敏感性試驗分類 定量方法 (MIC， mg/L) 瓊脂稀釋法 肉湯稀釋法 E-test 定性方法 (SIR) 紙片擴散法 自動化儀器 稀釋法的定義 以一定濃度的抗菌藥與含有被試菌株的培養(yǎng)基進行一系列對倍數(shù)稀釋，經(jīng)培養(yǎng)后肉眼觀察未見細菌生長管內(nèi)所含的最低藥物濃度為該藥對該試驗菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration， MIC) 稀釋法的最大優(yōu)點是可以精確測得藥物最低抑菌濃度，但需耗費較多材料、人力和時間。 稀釋法的分類 稀釋法藥敏試驗因介質(zhì)不同可分為液體稀釋法和瓊脂稀釋法。 因容器不同分為試管稀釋法和微量稀釋法，或稱常量法和微量。 前者使用無菌的13mm×100 mm試管，每一濃度抗菌藥的量至少為1ml； 后者使用8×12的U型底小孔的微量稀釋板，小孔內(nèi)裝有0.1ml肉湯。 瓊脂稀釋法又因在平皿中進行而稱為平皿稀釋法。 微量稀釋法的優(yōu)點為試劑材料較節(jié)省，而且微量板中可預先配制好抗菌藥和培養(yǎng)基，冷藏后一定時期內(nèi)使用，較為方便。 與試管稀釋法相比，瓊脂稀釋法配合多點接種器使用，可同時進行大量菌株的藥敏試驗，實驗結(jié)果重復性好，缺點是不能進行最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration， MBC)的測定。 與稀釋法藥敏試驗有關的指標有哪些？ MIC： 最低抑菌濃度 MBC： 最低殺菌濃度 MIC50： 抑制50%受試菌株的MIC值 MIC90： 抑制90%受試菌株的MIC值 MBC50： 殺死50%受試菌株的MBC值 MBC90： 殺死90%受試菌株的MBC值 瓊脂稀釋法 瓊脂選擇法是將藥物混勻于瓊脂培養(yǎng)基中，配制含不同濃度藥物平板，使用多點接種器接種細菌。 經(jīng)孵育后觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含藥物濃度為最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC ） 試驗菌的結(jié)果報告可用MIC（ug/ml ）或用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報告。 多點接種儀 試管稀釋法 微量稀釋法 微量稀釋法結(jié)果閱讀 E-試驗 E試驗原理 E試條（E-test）是一條 5mm×50mm的無孔試劑載體，一 面固定有預先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗生素，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。 將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗菌藥物對細菌的最低抑菌濃度（MIC） E-試驗結(jié)果閱讀 紙片擴散法 紙片擴散法原理 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上 紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度 在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。 紙片擴散法結(jié)果圖 規(guī)范化的藥敏試驗方法-擴散法(紙片法) 原理：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散，因此敏感細菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長受到抑制，根據(jù)抑菌圈的大小即可推知該藥物的最低抑菌濃度（MIC）。 正確的接種菌量 擴散法：0.5麥氏濁度（1.5×108CFU/ml） 菌苔厚度的要求 合適的培養(yǎng)基厚度 普通細菌 MH瓊脂培養(yǎng)基（Mueller－Hinton Agar） 培養(yǎng)基厚度：4mm 肺炎鏈球菌及其他鏈球菌 5％脫纖維羊血＋MH瓊脂培養(yǎng)基 嗜血桿菌屬 嗜血桿菌培養(yǎng)基（HTM）＋SR158添加劑 4.合適的培養(yǎng)條件 需氧菌： 35℃ ±2 ℃ ，16-18小時 嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌：20-24小時 葡萄球菌：33-35 ℃ ，苯唑西林、萬古霉素 24小時 腸球菌：萬古霉素-24小時 溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、奈瑟氏菌屬等：20-24小時 5.正確閱讀結(jié)果（紙片法） 工具：游標卡尺，尺子 光源：反射光、透射光 閱讀： 藥敏平皿背襯不反光的黑色背景用 肉眼觀察 也可用機器閱讀抑菌圈直徑 抑菌圈邊緣微弱生長的、僅能在放大鏡下才能觀察到的細小菌落應忽略 正確測量苯唑西林、萬古霉素和利奈唑胺對葡萄球菌；以及萬古霉素對腸球菌的抑菌圈直徑 結(jié)果判斷和報告：紙片擴散法—— 1株細菌1個藥1個標準 用精確度為1mm的游標卡尺量取抑菌圈直徑。 通常采用CLSI公布的藥敏結(jié)果判斷標準，采用三級劃分制。 臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI 是我國的部頒標準 結(jié)果判斷和報告 敏感（Susceptible）：當一種細菌引起的感染，用某種藥物常規(guī)量治療有效，這種細菌即對該藥高度敏感。 中度敏感（Intermediate）：當細菌引起的感染僅在應用高劑量抗菌藥物時有效，或者細菌處于體內(nèi)抗菌藥物濃縮的部位或體液（如尿、膽汁、腸腔等）中時才被抑制，這種細菌對該藥僅呈中度敏感。 耐藥（Resistance）：藥物對某一細菌的藥敏高于藥物在血或體液內(nèi)可能達到的濃度時，有時細菌能產(chǎn)生滅活抗菌藥物的酶，則不論其MIC值大小如何，仍應判定該菌為耐藥。例如產(chǎn)青霉素酶的金葡菌即應認為該菌對青霉素耐藥。 6.重要的質(zhì)控菌 腸桿菌科細菌：大腸埃希菌ATCC25922 非發(fā)酵菌： 銅綠假單胞菌ATCC27853 葡萄球菌： 金黃色葡萄球菌ATCC25923 腸球菌： 糞腸球菌ATCC29212 肺炎鏈球菌： 肺炎鏈球菌ATCC49619 嗜血桿菌： 流感嗜血桿菌ATCC49247 改變條件對于質(zhì)控的要求 改變條件對于質(zhì)控的要求 紙片法藥敏試驗結(jié)果異常分析 天然耐藥 （二）正確的抗菌藥物組合 原則：針對監(jiān)測細菌設計監(jiān)測藥物的品種和數(shù)量 CLSI抗菌藥物選擇的原則（A、B、C、U組） 根據(jù)病原菌的種類 革蘭陽性球菌 葡萄球菌、腸球菌 、鏈球菌等 革蘭陰性桿菌 腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌、不動桿菌等 根據(jù)本單位臨床實際需要 FDA批準臨床微生物室常規(guī)藥敏試驗分組 抗菌藥： A .為常規(guī)的一級(一線)試驗組合并常規(guī)報告結(jié)果 B. 亦可用于一級(一線)試驗，但應選擇性報告，即當A組藥物耐藥時可以選擇性地報告B組中的同類藥物 C. 為補充性藥物，可選擇性報告 U. 為補充性藥物，僅用于治療尿路感染的選擇用藥 補充性藥物選擇性報告的原則 對一線試驗組合的藥物耐藥 身體特殊部位 患者不能接受一線試驗組合的藥物 一線試驗組合的藥物對患者無效 復數(shù)菌感染 多部位感染 沙門菌屬、志賀菌屬細菌的抗菌藥物選擇 葡萄球菌的抗菌藥物選擇 (三)監(jiān)測菌種的要求 結(jié)核分枝桿菌、真菌和厭氧菌不列入耐藥監(jiān)測范圍 需監(jiān)測的臨床分離菌必須鑒定到種 葡萄球菌必須明確 MRS：甲氧西林耐藥 MSS：甲氧西林敏感 大腸埃希菌、克雷伯菌和奇異變形桿菌應明確 是否產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）？ 肺炎鏈球菌必須明確對青霉素的耐藥屬性 PRSP：青霉素耐藥 PISP：青霉素中度敏感 PSSP：青霉素敏感 Thank You！ItY紅軟基地

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