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梅毒實驗室檢測技術(shù)與評價 貴陽市疾病預(yù)防控制中心 謝 芳 學(xué) 習(xí) 內(nèi) 容一、梅毒的現(xiàn)狀及定義二、梅毒螺旋體的生物學(xué)特性三、梅毒實驗室檢查方法四、梅毒血清學(xué)診斷試驗五、梅毒血清學(xué)試驗的結(jié)果解釋六、梅毒實驗室操作要求七、存在的問題 一、梅毒的現(xiàn)狀及定義一、梅毒的現(xiàn)狀 1、近年來我國嚴(yán)峻的梅毒流行形勢（梅毒實驗室檢測不規(guī)范現(xiàn)狀）。 2、今年衛(wèi)生部出臺梅毒10年控制規(guī)劃（梅毒血清學(xué)檢測、新方法、新技術(shù)的應(yīng)用性評估） 3、目前我國僅對首次就診的孕產(chǎn)婦制訂了梅毒篩查方案，即：首先采用非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗或梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗之一進行初篩，當(dāng)篩查結(jié)果為陽性時，需用另一類試驗進行復(fù)檢。對一般人群尚無明確的篩查診斷流程。二、梅毒的定義梅毒是一種全球分布的系統(tǒng)性性傳播疾病。梅毒的病原體是蒼白螺旋體（Treponemia pallidum，TP）。人是梅毒的唯一傳染源，主要傳播途徑主要有性傳播、血液傳播和母嬰傳播3種，可侵犯人體全身器官，臨床表現(xiàn)分為一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潛伏梅毒，既能產(chǎn)生各種各樣的癥狀和體征，又可多年無癥狀而呈潛伏狀態(tài)，對人類健康危害極大。二、梅毒螺旋體的生物學(xué)特性 1.長度為8μm～20μm，平均8μm～10μm，直徑<0.2μm，有 6～12個螺旋。 2.因其透明不易染色，故稱為蒼白螺旋體。 3.梅毒螺旋是一種小而纖細的螺旋狀微生物。 4.梅毒螺旋體的特征是螺旋體整齊而規(guī)則，折光性強，較其他螺旋體亮。 5.運動緩慢而有規(guī)律，具有三種特征性運動方式：常見是圍繞其長軸旋轉(zhuǎn)前后移動；其次是全身彎曲如蛇行；少見的是伸縮其螺旋間距而前進 6.梅毒螺旋體至今還不能在人工培養(yǎng)基上生長繁殖，目前只能將其接種到兔睪丸內(nèi)增殖、傳代和保存。以橫斷分裂的方式進行增殖，世代時間為30小時～33小時。 7.梅毒螺旋體在體外不易存活，煮沸、干燥，一般的消毒劑如汞劑、石炭酸、乙醇等很容易將其殺死。在41℃～42℃時經(jīng)過1小時～2小時也可將其殺死。 8.低溫（-70℃～-196℃）下可保存數(shù)年并保持其形態(tài)、活力及毒性。 三、梅毒實驗室檢查方法梅毒的臨床實驗室檢測方法較多，概括起來分為梅毒的病原體檢查、梅毒的血清免疫學(xué)檢查和梅毒的核酸檢查3大類。（一）病原體檢查方法即梅毒螺旋體檢查，采用暗視野顯微鏡檢查或直接免疫熒光試驗(direct fluorescent antibody test，DFA)，在顯微鏡下觀察梅毒螺旋體的特征性形態(tài)和運動方式。該方法是診斷早期現(xiàn)癥最直接的方法，但由于受到患者用藥、檢測儀器狀態(tài)和檢測人員技能等條件的制約，本方法實際檢出率并不高。未檢測到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。本方法費時費力，也不適用于梅毒的大規(guī)模篩查。（二）血清免疫學(xué)檢查方法1 1、非梅毒螺旋體抗原試驗 檢測患者血清中宿主針對機體組織破壞后暴露的脂抗原或者螺旋體表面的脂質(zhì)產(chǎn)生的非特異性抗類脂抗原的抗體(反應(yīng)素)。檢測方法包括：快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗RPR)；甲苯胺紅不加熱血清(TRUST)；性病研究實驗室試驗(VDRL)；不加熱血清反應(yīng)素試驗(USR)。目前最常用的是RPR和TRUST。 由于在治療過程中反應(yīng)素滴度可呈動態(tài)變化，非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗常用于臨床療效觀察、復(fù)發(fā)或再感染的檢查。同時，由于該方法操作簡便、快速，成本低，特別適合基層應(yīng)用和人群調(diào)查。此類方法的缺點是反映不出既往感染，并且受其他疾病影響較大，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果 （二）血清免疫學(xué)檢查2 2、梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗 目的 檢測梅毒螺旋體IgG、IgM抗體。 檢測方法包括：梅毒螺旋體顆粒凝集試驗（TPPA）梅毒螺旋體顆血球凝集試驗（TPHA）梅毒酶聯(lián)免疫吸咐試驗（TP-ELISA）化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）梅毒快速檢測（TP-RT）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（TP-WB）。 梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗的共同優(yōu)點是特異性強，可以作為非梅毒螺旋體抗原試驗初篩陽性標(biāo)本的復(fù)檢或確證試驗 ，但是，由于感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈陽性，則患者長時間甚至終生陽性。所以這些方法不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染。亦不能作為療效觀察的指標(biāo)。（三）梅毒螺旋體核酸檢查 可對血漿、血清、皮損部位組織液、淋巴穿刺液及腦脊髓液等標(biāo)本的梅毒螺旋體核酸采用PCR進行檢測。核酸檢查的優(yōu)點是特異性高，在早期梅毒、神經(jīng)梅毒、先天梅毒和伴艾滋病梅毒等診斷中，以及螺旋體現(xiàn)癥感染和既往感染的鑒別診斷中具有一定的價值，也可應(yīng)用于梅毒螺旋體的耐藥性監(jiān)測、菌株流行病學(xué)分型。該方法缺點是成本高，對實驗條件要求高并且易受多種因素影響，不宜做療效觀察。四、梅毒血清學(xué)診斷試驗?zāi)壳�，梅毒的實驗室血清學(xué)診斷技術(shù)是檢測梅毒螺旋體抗體主要方法有兩類： 1.非梅毒螺旋體血清試驗 2.梅毒螺旋體血清試驗 （一）非梅毒螺旋體血清試驗1 非梅毒螺旋體抗原試驗 ：用心磷脂、卵磷脂、及膽固醇做抗原，檢測宿主對梅毒螺旋體表面的類脂物質(zhì)所產(chǎn)生的IgG和IgM抗體（抗心磷脂抗體，反應(yīng)素 ﹚包括VDRL、USR 、RPR、TRUST試驗等 性病研究實驗室玻片試驗（VDRL）：屬于沉淀反應(yīng)，目前應(yīng)用最廣泛。用心擬脂、卵磷脂、膽固醇為抗原，可作定性和定量試驗，操作簡單，費用低，常用作大量病人的篩選及療效觀察。但在一期梅毒時敏感性不夠高，以及弱陽性時判讀結(jié)果困難為其缺點。 　血清不需加熱的反應(yīng)素試驗（URS）：此法在國內(nèi)已逐步推廣使用，也是一種非螺旋體抗原原血清沉淀試驗。其原理是在VDRL所用抗原中加入了EDTA（乙二胺四醋酸）和氯化膽堿，使操作更為簡單，更便于讀結(jié)果，其敏感性與特異性和VDRL相同。 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(RPR):此試驗是VDRL試驗的一種改良方法。該法是在抗原中加入活性炭顆粒作為指示物，加入了氯化膽堿，因此血清不需滅活。特制的白色紙卡替代了玻片。試驗結(jié)果易于判斷，肉眼即可觀察。也可用血漿進行檢測，試驗結(jié)果可保存�？乖�放4℃冰箱可保存1年。 （一）非梅毒螺旋體血清試驗2 臨床應(yīng)用價值：簡便、快速、敏感性和特異性較好可用于大規(guī)模的人群和產(chǎn)前篩查指示目前疾病的活動程度可作定量試驗，用于療效觀察，早期梅毒經(jīng)有效治療后，抗體滴度會下降，並轉(zhuǎn)為陰性，如抗體滴度不下降或下降緩慢或下降后又上升，說明治療失敗、復(fù)發(fā)或再感染。晚期梅毒可自然轉(zhuǎn)陰。 材 料(以RPR為例) RPR試劑盒：含RPR抗原；直徑為18mm圓圈的特制白色反應(yīng)卡片；標(biāo)準(zhǔn)針頭（60±1滴/mL）；RPR試驗結(jié)果圖片。 　　其他：水平旋轉(zhuǎn)器。 定性試驗 a. 吸取0.05 mL血清或血漿加于卡片圈內(nèi)，并均勻地涂布在整個圈內(nèi)（每張紙卡有10個或12個反應(yīng)圈）； 　　b. 將抗原輕輕搖勻，用標(biāo)準(zhǔn)針頭吸取抗原，每個標(biāo)本加1滴抗原； 　　c. 將卡片置水平旋轉(zhuǎn)器旋轉(zhuǎn)8 min； 　　d. 立即在明亮光線下觀察結(jié)果。 結(jié)果 　　中到大的黑色絮狀物，液體清亮 3+~4+ 強陽性 　　小到中的黑色絮狀物，液體較清亮 2+ 陽性 　　小的黑色絮狀物，液體混濁 1+ 弱陽性 　　僅見活性炭顆粒集于中央一點或均勻分散 － 陰性 定量試驗 RPR定量試驗與TRUST試驗相同。 a.在圈內(nèi)加入0.05 mL等滲鹽水（一般作6～8個稀釋度）勿將鹽水涂開； b. 吸取0.05 mL血清或血漿作系列稀釋（1:2～1:64），當(dāng)稀釋到最后的第6孔時，棄去0.05 mL稀釋液。從第6孔起將血清稀釋液涂布整個圈內(nèi)，再涂布第5孔，依此向前到第1孔。 c. 滴加抗原，旋轉(zhuǎn)時間、速度和觀察結(jié)果同定性試驗。 RPR試驗結(jié)果（二）梅毒螺旋體抗原血清試驗梅毒螺旋體血清試驗方法有: 1.TPHA(梅毒螺旋體血凝試驗) 2.TPPA（明膠顆粒凝集試驗） 3.FTA－ABS（熒光抗體吸收試驗） 4.TP-ELISA（免疫吸附試驗） 5.TP-WB－TP和TPLA（蛋白印跡試驗） 方法簡便，結(jié)果易讀，適用于大量標(biāo)本的檢測。 FTA－ABS試驗是“金標(biāo)準(zhǔn)”試驗，具有敏感性高，特異性強等特點。不能作為觀察療效 優(yōu)點：特異性高， 對非特異性試驗進行證實 缺點：不能區(qū)分是新發(fā)感染或治療后， 通常終身持續(xù)陽性 梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA） 原理:TPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒，此致敏顆粒與人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見的凝集反應(yīng)。明膠顆粒為玫瑰紅色，便于肉眼觀察結(jié)果。 材 料（以TPPA為例） a. TPPA試劑盒：含蒸餾水（標(biāo)記A），用于溶解致敏顆粒、未致敏顆粒和質(zhì)控血清；標(biāo)本稀釋液（標(biāo)記B），用于稀釋血清標(biāo)本；致敏顆粒（標(biāo)記C），冷凍干燥品，用前30 min按規(guī)定量加A液溶解并混勻；未致敏顆粒（標(biāo)記D），冷凍干燥品，用前30 min按規(guī)定量加A液溶解并混勻；質(zhì)控血清（標(biāo)記E），冷凍干燥品，用時按規(guī)定量加入A液。 b. 其他：U型微量反應(yīng)板；微量加樣器 (25μL )；微量滴管 (C和D管)；移液管 (微量移液管和刻度滴管)；微量板振蕩器。 梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA） 定量試驗 a. 加B液至微量反應(yīng)板孔，第1孔～第4孔與定性試驗相同，第5孔～第10孔各加25μL； b. 取血清25μL加至第1孔，如定性試驗稀釋方法，從第2孔～第10孔混勻，混勻后第10孔棄去25μL； c. 第3孔加D液25μL，第4孔～第10孔各加C液25μL； d. 以后步驟同定性試驗。結(jié)果以最高血清稀釋度能產(chǎn)生陽性反應(yīng)的稀釋度為抗體滴度結(jié)果顆粒光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊 陽性 4+ 顆粒光滑覆蓋大部分孔底 陽性 3+ 顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一顆粒環(huán) 陽性 2+ 顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一明顯顆粒環(huán) 陽性 1+ 顆粒沉集孔底，中央形成一小點 可疑 ± 顆粒緊密沉積孔底中央 陰性 - 報告方法 a. 陽性報告：定性試驗，血清在1:80以上稀釋度與致敏顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)（1+或更強），與未致敏顆粒（第3孔）不發(fā)生凝集反應(yīng)。定量試驗則應(yīng)報告發(fā)生陽性反應(yīng)的血清最高稀釋度，為血清滴度。 b. 陰性報告：血清與致敏顆粒和未致敏顆粒均不發(fā)生凝集反應(yīng)。 注意事項 a. 微量反應(yīng)板要清潔干凈，孔內(nèi)無異物。 b. 加入血清后，使用微量板振蕩器振蕩反應(yīng)板，而不可使用水平旋轉(zhuǎn)儀。 c. 試劑盒不可置于0℃以下，防止凍結(jié)。不同批號試劑不可混合使用。 d. 如未致敏顆粒出現(xiàn)凝集反應(yīng)，應(yīng)將血清進行吸收處理后再進行試驗，或用其他試驗方法。 梅毒血清反應(yīng)的假陽性反應(yīng)（1）梅毒血清反應(yīng)假陽性的分類 ①技術(shù)性假陽性反應(yīng) 由于標(biāo)本的保存不當(dāng)（如細胞污染或溶血）、試劑質(zhì)量差或過期、或?qū)嶒炇也僮麇e誤所造成。 ②生物學(xué)假陽性反應(yīng) 是由于患者有其他疾病或生理狀態(tài)發(fā)生變化，使梅毒血清試驗出現(xiàn)陽性（2）急性生物學(xué)假陽性反應(yīng) 很多非梅毒螺旋體感染性疾病，如風(fēng)疹、水痘、傳染性單核細胞增多癥、病毒性肝炎、上呼吸道感染、肺炎球菌性肺炎、亞急性細菌性心內(nèi)膜炎、活動性肺結(jié)核、絲蟲病和溝端螺旋體病等。（3）慢性生物學(xué)假陽性反應(yīng) 可持續(xù)6個月以上或數(shù)年，甚至終生。五、梅毒血清學(xué)試驗的結(jié)果解釋 六、梅毒實驗室操作要求 1． 實驗室要求清潔明亮，溫度保存在23～ 29℃。 2．儀器設(shè)備制定詳細的操作說明書，定期維護。 3．玻璃器皿或耗材要清潔干凈。 4．試驗操作要適合工作需要，操作人員要持證上崗。 5．操作規(guī)程要確實可行，不得隨意改變。 6. 認真精確操作標(biāo)本和試劑，包括各種移液器和所操作的 用具量的準(zhǔn)確。 7．定期檢查說明書，操作保持與說明書的一致。 8． 每次試驗設(shè)立陽性和陰性質(zhì)控，包括反應(yīng)性，介質(zhì)和每次試驗操作記錄是否一致性； 9．標(biāo)本不應(yīng)溶血、乳糜狀，應(yīng)標(biāo)記血漿或血清，腦脊液是否有紅細胞； 10．常規(guī)實驗室應(yīng)具有一定的空間，所有試驗的記錄，試驗鑒定，溫度記錄和原始數(shù)據(jù)應(yīng)保留； 11．認真監(jiān)督報告方式和記錄筆誤。 12. 梅毒血清學(xué)試驗操作和結(jié)果分析 ⑴標(biāo)本的采集和分離 ①編號或姓名登記 ②采血、分離血清和貯存 ⑵試劑準(zhǔn)備 ①溫度、器具的校正 ②試劑、血清和反應(yīng)板恢復(fù)到試驗溫度 ③試劑鑒定 ⑶試驗操作 ①血清量的控制 ②試劑量的控制 ③旋轉(zhuǎn)儀速度和時間的控制 ⑷ 實驗報告 ①核對編號或姓名 ②試驗結(jié)果分析 ③重復(fù)試驗(結(jié)果與臨床表現(xiàn)不符) ④進一步與臨床核對（病理討論） ⑤登記結(jié)果 ⑥發(fā)送報告 七、存在的問題值得注意的是，臨床實驗室采用梅毒血清學(xué)方法檢測標(biāo)本時，由于方法學(xué)本身的局限性、患者的特殊情況、實驗條件和試劑或儀器的狀況等因素的影響，在結(jié)果判讀時，可能會出現(xiàn)假陰性或假陽性的情況。 1．前帶現(xiàn)象：是指臨床上符合梅毒體征，但未經(jīng)稀釋血清的TRUST或RPR實驗呈陰性或弱陽性，若將血清稀釋后重復(fù)實驗，便可出現(xiàn)陽性結(jié)果。原因是血清中抗心磷脂抗體過多，抑制了沉淀反應(yīng)的出現(xiàn)。為避免此類情況，不能只做原倍血清的檢測，可以同時作倍比稀釋血清的滴度檢測。 2．病程的影響：初期或晚期梅毒患者血清TRUST或RPR可呈假陰性。原因是感染初期，非特異性心磷脂抗體遲于特異性抗體出現(xiàn)在血清中，而晚期梅毒非特異性抗體可消失。因此，RPR實驗不適合一期、三期和治療后梅毒的診斷 3．溫度的變化：RPR是絮狀沉淀反應(yīng)，溫度可以改變絮狀物形成的速度，可能導(dǎo)致RPR假陰性。 4、操作不當(dāng)，可能導(dǎo)致實驗假陽性。 5．特殊人群導(dǎo)致非梅毒螺旋體抗原試驗假陽性：多見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、風(fēng)濕熱和系統(tǒng)性硬化等自身免疫性疾病患者，也可見于水痘、麻風(fēng)和病毒性肝炎等病毒感染性疾病。此外，一些老人和炎癥患者亦會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，可能和他們特殊的生理免疫狀態(tài)有關(guān)。 6．新生兒攜帶被動抗體導(dǎo)致RPR／TPPA檢測陽性：由于母體血梅毒螺旋體抗體IgG可經(jīng)胎盤傳給胎兒，使患兒血清呈被動陽性。因此，新生兒RPR或TPPA陽性時應(yīng)慎重診斷先天性梅毒。 因此，無論用何種方法檢測梅毒，其結(jié)果必須與臨床實際情況相結(jié)合，綜合分析各種情況，科學(xué)做出診斷，及時予以治療。 謝謝 咨詢電話：0851－5666207OFP紅軟基地

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