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質(zhì)粒的提取和純化 內(nèi) 容一.質(zhì)粒的概念和提取原理二.堿裂解法的實(shí)驗(yàn)操作和原理三.煮沸法快速提取質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)操作和原理四.實(shí)驗(yàn)室使用的方法五.質(zhì)粒純化后的檢測一.質(zhì)粒的概念和提取原理質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì)，如離開宿主細(xì)胞則不能存活，而宿主即使沒有它們也可以正常存活 . 一.質(zhì)粒的概念和提取原理質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型: 緊密控制型(Stringent control) 松馳控制型(Relaxed control) 一.質(zhì)粒的概念和提取原理在pH 12.0 ~ 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。 實(shí)驗(yàn)中使用的三個(gè)溶液 1，溶液Ⅰ： 葡萄糖—使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部. Tris.Cl (pH8.0)—提供反應(yīng)的最佳環(huán)境. EDTA (pH8.0) —Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，抑制DNase(脫氧核糖核酸酶)的活性和抑制微生物生長. 實(shí)驗(yàn)中使用的三個(gè)溶液 2，溶液Ⅱ：NaOH (臨用前用10mol/L NaOH 母液稀釋) 1％ SDS 注:要新從濃NaOH稀釋制備NaOH，是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性. NaOH細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化，瞬間就溶解. 當(dāng)然SDS也是堿性的，但是很弱，只能抽提得到少量質(zhì)粒 . 實(shí)驗(yàn)中使用的三個(gè)溶液 3，溶液Ⅲ： KAc 冰醋酸 ddH2O 注:冰醋酸的作用是為了中和過量的NaOH. KAc是提供K+和SDS反應(yīng)，取代Na離子，形成十二烷基硫酸鉀 (PDS)，而PDS是難溶于水的. SDS易和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了 ，同時(shí)長長的基因組DNA也一起被共沉淀了.但是SDS并不與DNA分子結(jié)合 . 二，堿裂解法的操作步驟 1，取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的含質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液，高速離心，棄上清，將離心管倒置使上清液全部流盡。 2， 加入溶液I，充分懸浮菌體細(xì)胞。 3，加入新配制的溶液II， 蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，冰浴5分鐘。 4，加用冰預(yù)冷的溶液III， 搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物，冰上放置15分鐘，此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。 5，4℃下離心15分鐘。 二，堿裂解法的操作步驟 6，取上清液，加入 RNA酶A， 37℃水浴20分鐘。 7，加入等體積的飽和酚/氯仿，振蕩混勻，4℃下高速離心10分鐘。 8，取上層水相， 加入等體積氯仿，振蕩混勻，4℃下高速離心10分鐘。 9，取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇 ，室溫放置幾分鐘 ，離心。 10，4℃下高速離心15分鐘， 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下高速離心5分鐘。 11，吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥 。 12，得到的質(zhì)粒樣品一般用TE緩沖液或者ddH2O進(jìn)行溶解. 注意的事項(xiàng)一，在加溶液Ⅱ后:①.時(shí)間不能過長，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；②.必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。二，加入的酚必須要用氯仿和乙醇洗滌干凈，否則對后面的實(shí)驗(yàn)有影響. 三，沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積)，且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數(shù)還是用乙醇。 四，提取質(zhì)粒DNA過程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨(dú)用酚或氯仿好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提 . 三，煮沸法快速提取質(zhì)粒的操作步驟 （1） 將 2ml 含相應(yīng)抗生素的 LB 培養(yǎng)基加入到容量為 15ml 的試管中，接種一單菌落，用棉塞封口，在 37 ℃劇烈震蕩（ 250rpm ）培養(yǎng)過夜。 （2） 將 1.5ml 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，在 4 ℃條件下離心 30 秒。 （3） 棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體培養(yǎng)基，將細(xì)菌沉淀物懸浮于 200 m l STET 緩沖液（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton， 50mmol/L EDTA，，10mmol/L Tris ） ，用渦旋混合器充分混勻。 （4） 加入 4 m l 新鮮配制的溶菌酶液，混勻，置室溫下 5min 。 （5） 用漂子架住離心管，置于沸水浴中，精確記時(shí) 45 秒，取出后立刻離心 10min 。 三，煮沸法快速提取質(zhì)粒的操作步驟（6） 用無菌牙簽挑取離心管中的沉淀物棄去，離心管的上清液中加入 8 m l 5%CTAB(十六烷基三甲基溴化氨) ，用混合器混勻后，高速離心 5min ，棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體。 （7） 加入 1.2M 氯化鈉 300 m l ，充分溶解沉淀物，再加入 750 m l 的冷乙醇，充分混勻后，離心 15min ，棄上清液。 （8） 取 1ml 70% 冷乙醇，緩慢淋洗離心管內(nèi)壁，離心 5min 。棄上清液，用濾紙吸干管壁上的液體，置室溫中使核酸沉淀自然干燥 5-10min 。 （ 9 ） 沉淀物溶于 50 m l TE 緩沖液中， 混合器混勻 。 （10） 即成質(zhì)粒制備液，制備的質(zhì)粒供下一步實(shí)驗(yàn)使用. 四，實(shí)驗(yàn)室使用的操作步驟 1，取1.5ml含細(xì)菌的培養(yǎng)液，離心，棄上清，將離心管倒置使上清液全部流盡。 2，加入溶液I，充分懸浮菌體細(xì)胞。 3，加入新配制的溶液II， 蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，冰浴5分鐘。 4，加用冰預(yù)冷的溶液III， 搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物，冰上放置15分鐘，此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。 5，4℃下離心15分鐘。四，實(shí)驗(yàn)室使用的操作步驟 6，取上清液加新的離心管中. 7，加入純化樹脂，混勻，放置10min. 8，將溶液轉(zhuǎn)移到離心純化柱中，高速離心. 9，倒掉下管中的溶液，再加80%異丙醇，洗滌兩次，每次離心30s，再干甩一次，20min. 10，將離心純化柱內(nèi)管取出，放入新的離心管中，加入30μl的ddH2O 洗滌，靜置10min，高速離心5min. 11.離心管中即得到溶于ddH2O的質(zhì)粒. 五，質(zhì)粒純化后的檢測eVX紅軟基地

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